不同高分子材料及有機溶劑體系對阿司匹林緩釋微球的影響

周雪， 肖潮達， 賀智勇， 姜豐， 吳林菁， 肖婷， 沈祥春， 陶玲

(貴州醫科大學 貴州省天然藥物資源高效利用工程中心 貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點實驗室 貴州醫科大學-貴陽市聯合重點實驗室 天然藥物資源優效利用重點實驗室 藥學院， 貴州 貴陽 550025)

阿司匹林(aspirin，Asp)已被廣泛應用了100余年。近年來，小劑量Asp在抑制動脈粥樣硬化[1-2]、預防和治療心肌纖維化[3-4]、抑制肺纖維化[5-6]、抗腫瘤[7-8]及心血管疾病等[9-11]方面發揮了新的作用，但目前Asp的上市劑型均需要長期多次給藥，血藥濃度波動大、胃腸道副作用大、病人的順應性差，限制了其臨床療效的發揮。微球(microspheres，MS)作為一種新型遞送系統，其給藥途徑廣泛，具有延緩或控制藥物釋放、增加制劑穩定性、提高藥物生物利用度、降低毒副作用、提高療效等優勢[12-14]，且合成可生物降解聚合物作為新型MS載體材料，由于其良好的生物相容性和生物可降解性，已被廣泛認可和應用[15-16]。由于藥物的物理化學性質不同，使用不同的高分子材料可以顯著改變藥物的載藥量和包封率[17-18]。本研究以包封率、載藥量為考察指標，對聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)和聚乙二醇-聚(乳酸-羥基乙酸)嵌段共聚物(PEG-PLGA)4種高分子材料對Asp 緩釋MS進行考察，另就2種不同有機溶劑體系對MS制備的影響進行了更全面的藥劑學性能研究，為制備不同要求的MS提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

S-3400N型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶麥克光電儀器有限公司)，Bettersize2000型激光粒度分布儀(丹東百特儀器有限公司)，STA-449C型差示掃描量熱儀(德國Netzsch公司)，D/Max-2200型全自動X射線衍射儀(日本理學公司)，Nicolet 6700型傅里葉變換紅外分析儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，JNM-ECS400型核磁共振譜儀(日本JEOL公司)；Asp原料藥[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號D1316056，純度99%]，Asp對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100113-201104，純度99.9%)，PLGA、PLA、PEG-PLGA及PCL(濟南岱罡生物工程有限公司，相對分子質量均為30 kDa)，乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1Asp緩釋MS的制備 (1)高分子載體材料的考察：根據藥物的理化性質和聚合物材料的性質，選擇4種不同類型的聚合物PLGA，PLA，PEG-PLGA，PCL，同時選取對MS制備工藝影響較顯著的3個因素[投藥比、O/W體積比及油相比例(DCM ∶ACE)]進行考察，以載藥量及包封率為主要考察指標，優選高分子載體材料。(2)Asp-PEG-PLGA-MS的制備[19]：根據前期實驗結果得到有機溶劑體系混合最佳比例，采用O/W型乳化溶劑揮發法制備Asp-PEG-PLGA-MSs，稱取適量Asp及PEG-PLGA溶解于1 mL混合有機溶劑體系中(DCM ∶ACE為3 ∶1 或 DCM ∶EA為1 ∶1)，渦旋混勻，作為油相。在1 000 r/min攪拌條件下將油相注入1% 聚乙烯醇(PVA)Asp飽和溶液中，冰浴條件攪拌，緩慢加入Asp水飽和溶液120 mL，20 min后調至室溫800 r/min攪拌4 h，靜置沉淀，去除上清液，抽濾，蒸餾水洗滌3次，室溫干燥，得到不同溶劑體系制備的MS。(3)MS載藥量及包封率的測定：稱取適量MS樣品，加入適量二氯甲烷，渦旋、離心、重復上述操作3次，合并上清液，二氯甲烷定容至25 mL；采用紫外分光光度法在波長276 nm處檢測吸光度，計算濃度，并照下式計算Asp緩釋MS的載藥量及包封率。載藥量=(MS中含藥量/最終MS實際重量)×100%，包封率=(MS中藥物含量/投入藥物量)×100%。

1.2.2MS的表征 (1)MS外觀形態觀察及粒徑測定：在倒置顯微鏡下，直接取少量MS觀察外觀形態；同時，將MS用離子濺射儀進行表面噴金處理，采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察，對MS的外觀和表面形態進行評價；室溫條件下，取Asp-PEG-PLGA-MSs混懸液適量，用激光粒度分析儀測定MS的粒徑及其分布。(2)差示掃描熱分析(DSC)：稱取Asp、PEG-PLGA、空白MS、Asp與各組空白MS的物理混合物，以及實驗制得的Asp-PEG-PLGA-MSs各10 mg，將上述樣品各兩種分別進行DSC分析，測試條件為0～180 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮氣氛20 mL/min。(3)X射線衍射分析(XRD)：各稱取Asp、PEG-PLGA、空白MS、Asp與各組空白MS的物理混合物，以及實驗制得的Asp-PEG-PLGA-MSs適量，將上述樣品各2組分別進行XRD分析，進一步觀察Asp在載體材料PEG-PLGA中的分散狀態，測試條件為Cu靶，管電壓/電流為40 kV/30 mA，掃描速度4°/min，掃描范圍為0～80°。(4)核磁共振分析(NMR)：分別稱取2組Asp、PEG-PLGA、空白MS、Asp與各組空白MS的物理混合物，以及實驗制得的Asp-PEG-PLGA-MSs各8.0 mg，溶于0.5 mL氘代氯仿中，在室溫下以1H-NMR 分析在制備過程前后Asp的核磁譜圖及研究制備過程對Asp的影響。(5)紅外光譜分析(FT-IR): MS中Asp與PEG-PLGA的相互作用通過傅立葉變換(FT-IR)進一步分析，分別稱取上述兩組的Asp、PEG-PLGA、空白MS及實驗制得的Asp-PEG-PLGA-MSs，加入適量干燥KBr粉末，充分混合均勻，再轉入模具中，分布均勻，抽真空下壓成透明薄片；裝入壓片夾進行 FT-IR掃描，在400～4 000 cm-1波長范圍內進行掃描。

1.2.3AspMS體外釋放度的考察 (1)體外累計釋放度的測定：采用動態透析法進行Asp-PEG-PLGA-MSs體外累計釋放度的測定。精密稱取各組MS 40 mg置入透析袋中，置于具塞錐形瓶中，加入PBS緩沖液50 mL，(37.0±0.5)℃恒溫水浴搖床以100 r/min的速度振搖，在一定時間點上分別取出PBS 5 mL，同時補加等量同溫的PBS緩沖液，隨后測定吸光度，計算累積釋放百分率，繪制釋放曲線。(2)載藥MS體外釋藥模型擬合：由于168 h后兩組載藥MS累計釋放百分率均接近100%，故采取零級動力學模型、一級動力學模型、Higuchi模型、Riger-Peppas模型，對優選處方制備的MS 168 h內體外釋藥曲線進行擬合。

2 結果

2.1 Asp緩釋MS的制備

2.1.1高分子載體材料的考察 如表1所示，PEG-PLGA制備的MS載藥量和包封率均最高。

表1 不同聚合物對AspMS的載藥量和包封率的影響(%)Tab.1 The drug loading and encapsulation efficiency of aspirin microspheres with various p polymers

2.1.2不同溶劑體系制備Asp-PEG-PLGA-MS比較 如表2結果所示，以DCM ∶EA為有機相制備所得Asp-PEG-PLGA-MSs平均載藥量、包封率及收率均明顯高于DCM ∶ACE組MS；反復實驗證實，當溶劑體系為DCM ∶EA，Asp用量為10 mg時，包封率均>120%，這可能與不同有機溶劑體系導致高分子材料對外水相中游離藥物的吸附能力不同有關，將進一步通過核磁共振分析來驗證。此外，在常規攪拌4 h除去有機溶劑后，MS在洗滌和收集過程中不黏附；然而，24 h后產生明顯黏附現象，可能是內部有機溶劑提取不完全所致；因此，本研究將MS靜置過夜，低速攪拌2 h后再進行收集，黏附現象明顯改善，且不影響載藥量。

表2 不同溶劑體系制備MS的載藥量、包封率及收率比較Tab.2 Different binary solvent systems for optimal microsphere preparation

2.2 MS的表征

2.2.1MS外觀形態觀察及粒徑測定 光學顯微鏡觀察結果表明，2種溶劑體系制備的Asp-PEG-PLGA-MSs均成球圓整，分布均勻。掃描電子顯微鏡下可見(圖1)，MS成球性良好，表面較光滑，略有小凹陷，可能為制備過程中有機溶劑揮發所致；室溫條件下，取Asp-PEG-PLGA-MSs混懸液適量，用激光粒度分析儀測定MS的粒徑及其分布，結果表明，以DCM ∶ACE及DCM ∶EA制備的ASA-PEG-PLGA-MSs粒徑分別為(100.9±2.52) μm及(142.4±3.25) μm。

注：A、B為DCM ∶ACE， C、D為DCM ∶EA；A、C為光學顯微鏡下(40×)，B、D為掃描電子顯微鏡下(800×)。圖1 光學顯微鏡與掃描電子顯微鏡下Asp-PEG-PLGA-MSs形狀Fig.1 Light micrographs and scanning electron microscopy photographs of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.2.2DSC結果 如圖2所示，2種溶劑組DSC結果無明顯差異，Asp與各組空白MS的物理混合物均有2個明顯的放熱峰(32～37 ℃為PEG-PLGA，142～145 ℃為Asp)，然而Asp-PEG-PLGA-MSs只有一個明顯的放熱峰(32～37 ℃為PEG-PLGA)，另一個所代表Asp的放熱峰消失了，說明制備所得MS并不是2種物質的簡單物理混合。

圖2 Asp-PEG-PLGA-MSs的DSC結果Fig.2 The DSC results of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.2.3XRD結果 如圖3所示，Asp、Asp與各組空白MS的物理混合物的特征圖譜在0～30°均有很強的Asp結晶衍射峰；而兩組不同溶劑體系制得Asp-PEG-PLGA-MSs的圖譜中無明顯的Asp結晶衍射尖鋒，說明Asp-PEG-PLGA-MSs并不是簡單的物理混合，可能Asp制成MS后其晶型發生了變化，藥物可能以無定形狀態分散于載體材料中。

注：A為DCM ∶ACE， B為DCM ∶EA。圖3 Asp-PEG-PLGA-MSs的XRD分析結果Fig.3 The XRD results of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.2.4NMR結果 如圖4所示，Asp的δ 7.14、7.35、7.62和8.12分別為苯環的次甲基(—CH—)質子峰，δ 2.34為甲基(—CH3)質子峰；PEG-PLGA的δ 5.20和1.65 分別為PLA的次甲基(—CH—)和甲基(—CH3)質子峰，δ 4.81為PGA的亞甲基 (—CH2—)質子峰，δ 3.63為PEG的亞甲基(—CH2—)質子峰；同時，空白MS、Asp與PEG-PLGA物理混合物均在相應位置有質子峰，而Asp-PEG-PLGA-MSs在δ 6.90、6.95、7.48與7.90也有質子峰的出現，這表明Asp可能向高場發生了化學位移，其可能是Asp的晶型改變所致。

圖4 Asp-PEG-PLGA-MSs的1H-NMR結果Fig.4 The 1H-NMR results of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.2.5FT-IR結果 如圖5所示，在Asp原料藥的IR圖譜中，Asp明顯的特征峰均存在：δ= 1 696 cm為環上COOH羰基伸縮，δ=1 758 cm-1為接苯環CH3CO中的酯羰基伸縮，δ=1 610、1 570、1 480 cm分別為苯環的C骨架伸縮；高分子材料PEG-PLGA的IR譜中，δ=1 760 cm-1處有強吸收峰，為酯羰基C=O的伸縮振動吸收峰，在δ=3 502 cm-1附近寬吸收峰為兩端的OH吸收峰，δ=2 881 cm為C-H的伸縮振動吸收峰；2類空白MS以及Asp-PEG-PLGA-MSs的IR譜中，特征峰未發生明顯改變；說明Asp制備成MS后，藥物與PEG-PLGA結構中的主要基團未發生改變。

圖5 Asp-PEG-PLGA-MSs的FT-IR結果Fig.5 The FT-IR results of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.3 AspMS體外釋放度考察

2.3.1體外累計釋放度 如圖6所示，分別以一定比例的DCM ∶ACE與DCM ∶EA為溶劑的最佳工藝制備所得MS，在體外釋放實驗中釋放MS所含80%藥物所需時間分別不低于96 h與72 h，完全釋放分別需要不低于120 h與168 h，而Asp原料藥在同一條件下，24 h釋放基本完全，說明MS有較好的緩釋作用。

圖6 不同溶劑體系制備Asp-PEG-PLGA-MSs的體外釋藥曲線Fig.6 In vitro release profile of Asp-PEG-PLGA-MSs prepared with different solvent systems

2.3.2載藥MS體外釋藥模型擬合結果 如表3所示，Riger-Peppas 模型對2組MS釋藥曲線擬合的相關系數均最大，故2組Asp-PEG-PLGA-MSs的體外釋藥比較符合Riger-Peppas釋藥模型。DCM ∶ACE組，lnQ=0.455 6 lnt+2.225 9、r2=0.982 2；DCM:EA組，lnQ=0.466 5 lnt+2.248 7、r2=0.980 8，即Asp從MS中釋放方式均為溶蝕型。

表3 Asp-PEG-PLGA-MSs 體外釋放模型擬合Tab.3 The fitting result of Asp-PEG-PLGA-MSs in vitro release

3 討論

本研究在對PLGA、PLA、PCL 及PEG-PLGA幾種高分子材料優選中，以PEG-PLGA作為MS載體時，載藥量和包封率明顯高于其他高分子材料，這可能與PEG-PLGA的兩親性，以及Asp具有的微小溶解性能(水中溶解度為3 g/L)有關。

不同有機溶劑具有不同的物理性質，如黏度、表面張力、水溶性及蒸汽壓等，都直接影響MS的粒徑大小、載藥量、包封率、穩定性及體外釋放。有機溶劑溶解度越高，向水中擴散速度越快，而乙酸乙酯的溶解度介于二氯甲烷和丙酮之間；蒸汽壓越高，脫除速率越快，導致聚合物的沉積與固化速率加快[20]，乙酸乙酯的蒸汽壓低于丙酮和二氯甲烷。因此，乙酸乙酯彌補了丙酮被快速萃取，將藥物一并帶出的不足，進而提高了載藥量和包封率。另外，采用DCM ∶EA制備Asp-PEG-PLGA-MSs，投藥量在10 mg時，包封率均超過100%，原因可能是在上述溶劑特性的影響下，當乳滴進入PVA飽和Asp溶液后，MS固化過程中，外水相中的游離Asp被吸附于MS表面所導致。

本研究的DSC和XRD分析結果表明，所制得MS并不是藥物與載體材料的簡單物理混合，而是藥物可能以無定形狀態分散在載體材料中。此外，本研究還采用NMR與IR考察Asp與PEG-PLGA在不同溶劑中的化學結合，結果發現Asp與PEG-PLGA在主要功能基團上未發生結合，但是IR圖譜中表明，2組空白MS和高分子材料PEG-PLGA在一些非功能基團上發生了一定改變。

體外累計釋放度的測定結果顯示，2組MS體外初始釋放時，釋放藥物速度均較高，可能是由于MS表面吸附的Asp在釋放初期迅速解吸附導致。此外，由于MS體外初始釋放時藥物濃度較高，具有較大的勢能，更加促進藥物的擴散[21]。24 h后，隨著表面藥物的完全釋放，藥物MS的釋放隨之受到載體材料降解速度的限制，使MS以較為恒定的速度緩慢釋放藥物。另外，2組MS的體外釋藥在48～96 h內略有不同，藥物從DCM ∶EA組MS釋放較DCM ∶ACE組稍多，這可能與其載藥量和粒徑大小相關：DCM ∶EA組MS的載藥量幾乎是DCM:ACE組MS載藥量的兩倍，DCM ∶EA組MS的粒徑超過DCM ∶ACE組MS的40%，有明顯更大的比表面積。

綜上，綜合上述各項性能指標結果可知，不同高分子材料和有機溶劑體系共同影響載藥MS的粒徑、形態、載藥包封及釋放行為。這為制備不同要求的AspMS提供了參考價值與依據。