唾液酸對急性酒精性肝損傷小鼠的抗氧化作用

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(1.北京大學公共衛生學院,北京 100191;2.食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室,北京 100191;3.中科鴻基生物科技有限公司,山西晉中 031100)

唾液酸又稱燕窩酸,現代研究證明唾液酸含量可占燕窩干重的7%～15%左右[1],是燕窩的重要特征成分[2],最初從牛頜下腺黏蛋白中分離而出,由此得名。唾液酸是一類九碳單糖的衍生物,也是所有神經氨酸或酮基-脫氧壬酮糖酸(KDN)的N-或O-衍生物總稱[3],位于細胞膜糖蛋白側鏈末端,是細胞膜表面受體的重要組成部分[4]。目前已經有很多唾液酸生物學功能的研究,其中以N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac,NANA)的研究居多。

唾液酸具有多種的生理功能,如外源性唾液酸的添加可以改善子代學習記憶[5-6]、減輕動脈粥樣硬化[7]、預防高脂飲食誘導的高脂血癥[8]等;內源性唾液酸可以用來預測和評估人類疾病潛在風險[9-11]等,此外有研究發現唾液酸可能具有抗氧化功能。何培元等[12]通過手術摘除大鼠卵巢誘導肝臟氧化應激,利用燕窩調節肝細胞抗氧化通路中相關基因SOD 1/2/3及PARP 1的mRNA表達,發揮抗氧化作用,進而保護肝細胞,基于唾液酸在燕窩中重要功能特性原因,推測燕窩調節抗氧化功能可能與其中的唾液酸有關。此外研究表明NANA可作為抗氧化劑與H2O2反應,產生H2O與無毒羧酸,且不會產生氧自由基[13]。該反應在體內任何pH環境下都有可能發生,在pH大于5時,H2O2的濃度下降速度更快[14]。同時在肥胖相關疾病的研究中發現,NANA可以預防高脂膳食誘導的炎癥和氧化應激反應[7-8]。目前關于對唾液酸改善乙醇所致的氧化損傷尚未見報道,無對于唾液酸抗氧化能力的劑量反應關系的相關研究。

為進一步探索唾液酸對乙醇所致氧化損傷的改善作用以及其最佳作用劑量,本研究以ICR小鼠建立急性酒精肝損傷的動物模型,探索唾液酸對小鼠氧化應激的保護作用,并初步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

唾液酸(純度≥98.0%,CAS:131-48-6) 中科鴻基生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測試盒、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)測試盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測試盒、蛋白質羰基(Protein Carbonyl,PC)試劑盒、蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所;SPF級ICR雄性小鼠(50只,體重(25.0±5.0) g,實驗動物合格證號:SCXX(京)2016-0010,6～7周齡)、飼料 北京大學醫學部實驗動物科學部。

SPN3001F電子分析天平 奧豪斯;FLUO star Omega多功能酶標儀 美國BMG LABTECH公司;BFX5-320型低溫自動平衡離心機 北京白洋離心機廠;Allegra X-30R Centrifuge臺式高速冷凍離心機 美國BECKMAN COULTER公司;HH·S11-1電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 小鼠給予維持飼料,光/暗周期12 h/12 h(光照時間07:00～19:00),室內溫度為(23±2) ℃,濕度為50%～60%,50只雄性ICR小鼠經適應性飼養1周后,稱重,按體重隨機分為5組,分別為空白對照組、模型組、唾液酸低、中、高劑量組(低劑量組:15 mg/kg·bw;中劑量組:30 mg/kg·bw;高劑量組:60 mg/kg·bw),每組各10只。各組均給予維持飼料,自由進食、飲用無菌去離子水。

1.2.2 造模及給藥方法 實驗期間每天上午8:00～10:00對各劑量組進行灌胃,給予不同劑量的受試樣品,對照組和模型組經口灌胃雙蒸水,灌胃容量為0.1 mL/10 g,并根據體重來調整灌胃劑量,灌胃期間自由取食和飲水。連續30 d灌胃并每隔5 d記錄體重和攝食量。末次灌胃后,模型組和3個劑量組禁食16 h(過夜),然后一次性灌胃給予50%乙醇12 mL/kg·bw,6 h后取材(空白對照組不作處理)。每5 d在同一時間上午10:00記錄體重與食物消耗量,并計算食物利用率。

食物利用率(%)=體重增加量×100/鼠糧消耗量

1.2.3 測試樣品的制備和檢測 實驗小鼠灌胃乙醇6 h后,摘眼球取血,3000 r/min離心10 min(用于測血清SOD、GSH-Px、GSH和MDA)。

斷頸處死后取肝組織在預冷的0.9%生理鹽水中漂洗,洗凈組織表面血跡,并用濾紙吸干水分。稱重后放入10 mL離心管中,加入體積是肝組織重量9倍的冷0.9%生理鹽水,用眼科小剪刀迅速剪碎組織,冰水浴組織搗碎機制備組織勻漿液,4 ℃下3000 r/min離心10 min,取上清進行測定。

1.2.4 指標測定 SOD和GSH-Px活性,GSH、MDA、蛋白質羰基和總蛋白含量指標檢測參照對應試劑盒說明書進行測定。

1.3 數據處理

實驗結果表示為平均值±標準差(Mean±SD)。所有數據使用SPSS 22.0軟件進行統計分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較組間差異,以P<0.05作為差異具有統計學意義的判斷標準。方差齊時,采用LSD法進行兩兩比較;方差不齊時,采用Tamhane’s法進行兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重變化

由圖1、表1可知,適應性喂養后各組動物的初始體重無明顯差異,體重隨實驗時間的延長而增加,同時各組小鼠的食物利用率無顯著性差異(P>0.05)。實驗中小鼠體重由30 g左右增長至35 g左右,小鼠體重增長緩慢,增重率逐漸下降,在飼料消耗量一直保持穩定的趨勢下,食物利用率處于降低趨勢。實驗過程中小鼠無異常表現,表明唾液酸在實驗劑量范圍內對小鼠無毒性作用,對其正常生長發育無影響。

圖1 唾液酸對小鼠體重的影響Fig.1 Effects of sialic acid on the weight of mice

表1 唾液酸對小鼠食物利用率的影響Table 1 Effects of sialic acid on food utilization rate of mice

注:與空白對照組相比,*代表顯著差異P<0.05,**代表極顯著差異P<0.01;與模型對照組相比#代表顯著差異P<0.05,##代表極顯著差異P<0.01;表2～表6同。

2.2 唾液酸對小鼠SOD活力的影響

小鼠血清和肝臟中SOD活力結果見表2。與空白對照組相比,模型組血清和肝臟中SOD活性均顯著降低(P<0.01),表明實驗造模成功。與模型組相比,中劑量組血清和肝臟中SOD活性均提升顯著(P<0.05)。

表2 唾液酸對小鼠抗氧化酶SOD活力的影響Table 2 Effects of sialic acid on activity of SOD in mice

2.3 唾液酸對小鼠GSH-Px活力的影響

由表3可知,與空白對照組相比,模型組小鼠血清中GSH-Px活性顯著降低(P<0.05),肝臟中極顯著降低(P<0.01),表明實驗造模成功。在血清中高劑量組較模型組酶活性提升顯著(P<0.01),但肝臟中各劑量組GSH-Px活力較模型組未見顯著差異(P>0.05)。

表3 唾液酸對小鼠抗氧化酶GSH-Px活力的影響Table 3 Effects of sialic acid on activity of GSH-Px in mice

2.4 唾液酸對小鼠GSH 含量的影響

如表4所示,模型組血清和肝組織中GSH的含量顯著低于空白對照組(P<0.01),表明造模成功;唾液酸各劑量組小鼠血清中GSH含量均顯著高于模型組(P<0.05),但在肝臟中,各劑量組GSH含量較之模型組未見顯著差異(P>0.05)。

表4 唾液酸對小鼠GSH含量的影響Table 4 Effects of sialic acid on the content of GSH in mice

2.5 唾液酸對小鼠MDA含量的影響

由表5可知,與空白對照組相比,模型組血清和肝臟中MDA含量極顯著增加(P<0.01),表明實驗造模成功。血清中唾液酸中、高劑量組MDA 含量極顯著低于模型組(P<0.01),而肝臟中,各劑量組相對于模型組MDA有所降低,但未見顯著差異(P>0.05)。

表5 唾液酸對小鼠MDA含量的影響Table 5 Effects of sialic acid on MDA in mice

2.6 唾液酸對小鼠肝組織PC含量的影響

由表6可知,模型組小鼠肝臟中PC含量顯著高于空白對照組(P<0.01),表明實驗造模成功。唾液酸各劑量組小鼠肝臟中PC含量均低于模型組,但僅中劑量組含量顯著降低(P<0.05)。

表6 唾液酸對小鼠蛋白質羰基含量的影響Table 6 Effects of sialic acid on PC content in mice

3 討論與結論

本研究以小鼠機體非酶系抗氧化物GSH含量、抗氧化酶系SOD、GSH-Px活性及氧化損傷典型產物PC和MDA含量為檢測指標,探究唾液酸對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用。結果顯示模型組較空白組SOD、GSH-Px酶活性、GSH含量顯著降低,PC及MDA含量顯著提升,表明本實驗急性肝損傷小鼠造模成功。唾液酸劑量組較模型組,GSH、GSH-Px(給藥60 mg/kg·bw唾液酸)及MDA在血清中表現出了顯著性差異,給藥30 mg/kg·bw唾液酸后PC含量在肝組織中顯著降低,而給藥30 mg/kg·bw唾液酸后抗氧化酶系SOD在血清和肝組織中均有顯著提升,表明受試物唾液酸具有保護抗氧化損傷作用。

機體在急性酒精暴露下,活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增加或抗氧化酶活性降低。ROS如超氧陰離子自由基、羥基自由基和H2O2在能量轉換過程中不斷產生,同時生物體處于氧化應激狀態[15]。受試物對急性酒精誘導的氧化損傷模型小鼠的保護作用可能是通過提升小鼠體內抗氧化酶系活性、清除體內自由基、降低氧化應激產物含量等途徑實現的。

GSH與谷胱甘肽-S-轉移酶和GSH-Px結合,在細胞對ROS的防御機制中起著十分重要的作用[17]。本研究結果中唾液酸各干預組GSH含量均有顯著提升,表明唾液酸對于酒精誘導的急性氧化應激保護作用可能是由于GSH氧化還原平衡調節的結果,推測唾液酸在保護細胞免受ROS施加的自由基應激中起到關鍵作用。

相關研究表明酒精的大量攝入會改變體內的脂質平衡并導致脂質過氧化產物如MDA的大量生成[18]。本實驗結果表明唾液酸中、高劑量組血清中MDA含量較模型組均有顯著降低。相關研究證實NANA可以通過與H2O2反應的相同方式降低脂質氫過氧化物的細胞毒性[19]。何培元等12]實驗結果與本實驗中作為燕窩重要功能成分的唾液酸結論相符。此外,PC含量也是氧化應激的重要標志之一,是評估細胞氧化損傷程度及衡量自由基對機體的損傷的重要手段[20]。本實驗中唾液酸中劑量組PC含量較之模型組顯著降低,推測唾液酸可以通過與自由基結合保護機體中蛋白質,避免酒精急性氧化應激造成的分子羰基化修飾。

不同劑量的唾液酸干預對抗氧化劑及氧化應激產物的作用呈現出不同效果,提示唾液酸干預可以在一定程度上整體改善機體氧化應激水平,而這種改善效應具有一定的劑量依賴性。中劑量組的抗氧化防御效果最好。但未能觀察到顯著的劑量-效應關系。因此推測一定劑量的唾液酸干預具有抗氧化作用,但存在適宜的劑量范圍。

本研究通過聚焦外源性唾液酸的補充對于氧化應激的保護作用,為唾液酸保肝護肝相關功能性產品開發提供新思路,目前本研究還存在著許多問題,需要進一步開展深入的機制研究,以探索其具體改善氧化損傷介導的肝損傷機制。此外,仍需進一步的人群實驗,開展相關干預性研究,以驗證唾液酸的保肝護肝功能。