大豆肽對力竭運動大鼠血流動力學及心肌自噬水平的影響

,*

(1.漯河醫學高等專科學校,河南省腫瘤發生與防治創新型科技團隊,河南漯河 462002;2.河南省南街村(集團)有限公司,河南臨潁 462600)

力竭運動(Exhaustive exercise,EE)是指機體活動超出機體承受能力直至無法再運動,是一種超強度、超負荷運動,因此機體對血、氧及能量的需求急劇增加,還會不斷生成自由基,勢必會對組織器官造成不同程度的損傷[1]。心臟是機體重要的供血循環動力器官,對缺血缺氧十分敏感,極易誘發病變,這也是引發運動員心律失常、心功能衰竭甚至猝死的主要原因[2]。細胞自噬(Autophagy)是指真核細胞利用溶酶體將胞內受損變性蛋白、有害因子或衰老細胞器進行消化降解的程序化過程[3]。正常水平的自噬是機體維持內環境穩態的正常生理過程,使機體免受損傷刺激的傷害,但若自噬過度亦可損傷正常細胞器或蛋白分子,誘發或加重器官組織損傷[4]。研究報道,力竭運動造成的心肌缺血缺氧損傷可誘導和提高心肌細胞自噬水平,導致心肌損傷或壞死等病理變化,出現心功能障礙[5-6]。

大豆肽(Soybean peptide,SP)是由大豆蛋白粉經微生物發酵或酶解而得到一種短肽混合物,含有人體所需的8種必需氨基酸成分,易于消化和吸收。研究表明,大豆肽具有抗氧化、調血脂、抗疲勞、抗腫瘤及免疫調節等藥理作用[7-8]。研究發現,大豆肽對力竭運動大鼠心臟具有一定的保護作用,其機制可能與抗氧化應激和抑制NF-κB信號通路有關[9]。本文將大豆肽灌胃給藥力竭運動大鼠,觀察其對大鼠心臟血流動力學及病理學改變的影響,同時檢測大鼠心肌組織微管相關蛋白輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、Beclin-1及自噬相關因子7(Autophagy-related gene 7,Atg7)等自噬因子的表達變化,探討其抑制自噬相關作用機制,為提升其營養價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康SD大鼠(動物許可證號:SYXK(湘)2014-0006) SPF級,雄性,8～10 w齡,體重180～220 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,將大鼠置于鼠籠中飼養,每籠4～5只,飼養室溫度為22～25 ℃,濕度50%～60%,光照周期12 h:12 h,自由飲食水;大豆肽 分子量為500～3000 Da,臨用時用蒸餾水混懸,河南省南街村(集團)有限公司;戊巴比妥鈉 美國Sigma公司;肝素鈉注射液 江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司;LC3、Beclin-1、Atg7、β-actin抗體(兔抗鼠)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液(強)、彩色預染蛋白分子量Marker(10～170 kDa)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗、ECL顯色液、PVDF膜、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、總RNA提取Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒等 上海碧云天生物技術有限公司南通分公司;PCR引物設計與合成 上海捷瑞生物工程有限公司。

DW-86L578J超低溫冰箱 海爾生物醫療設備有限公司;FA1004電子分析天平 上海光學儀器廠;H1850高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;Mini-PROTEAN? Tetra垂直電泳槽、T100TMPCR儀、Sub-Cell GT 水平電泳槽、ChemiDocTMXRS+化學發光凝膠成像系統等 美國Bio-Rad公司;BL-420F生物信號采集與分析系統 成都泰盟生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 大鼠適應性飼養5 d,置于盛有自來水的游泳訓練水桶(高60 cm、直徑100 cm),水深50 cm,設置水溫為(33±2) ℃,將不會游泳或游泳能力較差(游泳時間<5 min)的大鼠去除。將篩選后的大鼠分為正常對照組(Control)、力竭運動模型組(Model)及大豆肽高、中、低劑量組,共5組,每組10只。正常對照組灌胃蒸餾水,不進行強迫運動;力竭運動模型組灌胃蒸餾水,并強迫游泳至力竭;大豆肽高、中、低劑量組分別灌胃大豆肽500、250及125 mg/kg,并強迫游泳至力竭。給藥容量均為0.1 mL/100 g,每次于游泳前2 h灌服,連續4 周。

1.2.2 力竭運動大鼠動物模型的制備 將大鼠尾部用鉛絲捆綁負重(鉛絲重量為體重5%)放入游泳訓練水桶中,使其連續游泳直至力竭。大鼠運動至力竭的判斷標準:大鼠在水中持續游動直至不能再動,并沉入水中10 s以上不能上浮[9-10]。正常對照組常規飼養,不進行游泳運動;力竭運動模型組及大豆肽組大鼠均進行力竭游泳運動,隔2 d休息1次,持續4 w。末次力竭運動后,進行大鼠血流動力學、心肌組織病理學及相關因子的mRNA和蛋白表達水平測定。

1.2.3 大鼠血流動力學的測定 大鼠麻醉后仰臥固定于手術臺上,于距離下頜2 cm至鎖骨上1 cm處切開頸部皮膚約1 cm,逐層分離肌肉,游離右頸總動脈約2～4 cm,結扎遠心端,用動脈夾夾閉近心端,將充滿肝素鈉注射液的心導管順著頸總動脈向心臟方向緩慢推進至預定部位,松開動脈夾,并及時打開BL-420F生物信號采集與分析系統壓力傳感器上的三通管閥門,在計算機上觀察到動脈血壓曲線,此時繼續推進心導管,直至在計算機屏幕上觀察到明顯的心室搏動波形,表明心導管已插入左心室,固定心導管,30 min后待波形穩定后記錄大鼠LVEDP、LV dp/dt max、LV dp/dt min、LVSP、MABP及HR等參數[11]。

1.2.4 大鼠心肌組織病理學檢測 取大鼠心尖組織約100 mg,生理鹽水沖洗干凈后,放入4%多聚甲醛溶液中固定,然后依次脫水、透明、浸蠟和包埋,切片(4 μm)后用HE染色,于顯微鏡下觀察心肌組織病理學變化。

1.2.5 RT-PCR法檢測大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達水平 取大鼠心肌組織約50 mg,用PBS沖洗干凈,用眼科剪快速充分剪碎,置于1.5 mL EP管中,加入1.0 mL Trizol并劇烈震蕩使其充分反應,4 ℃12000 r/min離心15 min,按照RNA提取試劑說明書進行操作,提取總RNA,進行逆轉錄合成cDNA,然后進行PCR擴增實驗。

表1 大豆肽對力竭運動大鼠左心室血流動力學參數的影響(n=10)Table 1 Effects of SP on left ventricular hemodynamic parameters in rats with exhaustive exercise(n=10)

注:與正常對照組比較:*表示P<0.05,差異顯著,**表示P<0.01,差異極顯著;與模型組比較:#表示P<0.05,差異顯著,##表示P<0.01,差異極顯著;表2～表3同。各基因引物序列為LC3-F:5′-CTCTGTCATGGATGGAACCCAA-3′,LC3-R:5′-TACAGGTGTCACACAACGGAG-3′,產物255 bp;Beclin-1-F:5′-GAATGGAGGGGTCT AAGGCG-3′,Beclin-1-R:5′-CTTCCTCCTGGCTC TCTCCT-3′,產物180 bp;Atg7-F:5′-ACCCCAGG ACTGGTGATCTG-3′,Atg7-R:5′-GACACAGGAAA GGGTGCAACT-3′,產物107 bp;β-actin-F:5′-AACACCCCAGCCATGTACG-3′,β-actin-R:5′-ATGAGGGAGCGCGTAACC-3′,產物138 bp。

PCR反應體系:cDNA 5 μL,上游引物5 μL,下游引物 2 μL,2×PCR MasterMix 1 μL,ddH2O 12 μL。

PCR反應條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環;72 ℃延伸10 min。于2.0%瓊脂糖凝膠上將擴增產物電泳,凝膠成像系統下拍照成像,讀取條帶光密度值并計算LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA 相對表達水平。

表2 大豆肽對力竭運動大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達水平的影響(n=10)Table 2 Effects of SP on expression levels of mRNA of LC3,Beclin-1and Atg7 in myocardial tissue of rats with exhaustive exercise(n=10)

1.2.6 Western blot法檢測大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達水平 取大鼠心臟組織約100 mg,用眼科剪充分剪碎,置于2 mL離心管中,加入0.5 mL RIPA裂解液后用電動勻漿器充分勻漿并反應約15 min,移入1.5 mL EP管中,12000 r/min 4 ℃ 離心15 min,取上清即為蛋白提取物,然后進行蛋白定量并調整各樣本蛋白至10 μg/μL,按照Western blot 實驗步驟進行電泳、轉膜、封閉、孵育一抗、二抗、顯影及拍照等操作,以β-actin條帶灰度值為內參,分析LC3、Beclin-1及Atg7 蛋白相對表達水平。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 大豆肽對力竭運動大鼠心臟血流動力學的影響

如表1,與正常對照組比較,力竭運動模型組大鼠LVEDP極顯著升高(P<0.01),LV dp/dt max、LV dp/dt min、LVSP及MABP極顯著降低(P<0.01)。與力竭運動模型組比較,大豆肽500 mg/kg組大鼠LVEDP極顯著降低(P<0.01),LV dp/dt max、LVSP及MABP極顯著升高(P<0.01),LV dp/dt min顯著升高(P<0.05);大豆肽250 mg/kg組大鼠LVEDP極顯著降低(P<0.01),LV dp/dt max、LVSP及MABP極顯著顯著升高(P<0.01);大豆肽125 mg/kg組大鼠LVEDP顯著降低(P<0.05)。

2.2 大豆肽對力竭運動大鼠心肌病理學變化的影響

心肌組織HE染色鏡下觀察顯示,正常對照組心肌結構完整,橫紋清晰,未見明顯病變(圖1A);力竭運動模型組大鼠表現為廣泛的心肌肌束紊亂,細胞明顯腫脹,可見部分細胞變性、壞死,心肌間質有大量白細胞浸潤(圖1B);大豆肽500 mg/kg組大鼠心肌組織較模型組明顯改變,橫紋趨于清晰,可見散在、少量的白細胞浸潤(圖1C)。

圖1 大豆肽對力竭運動大鼠心肌組織病理學變化的影響(200×)Fig.1 Effects of SP on myocardial histopathologicalchanges in rats with exhaustive exercise注：A為正常對照組，B為力竭運動模型組，C為大豆肽500 mg/kg組。

2.3 大豆肽對力竭運動大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達水平的影響

如圖2,模型組中LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA條帶光密度增加;500 mg/kg大豆肽劑量組與模型組相比條帶光密度降低。如表2,與正常對照組比較,力竭運動模型組大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達水平極顯著上調(P<0.01);與模型組比較,大豆肽500 mg組大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達水平極顯著下調(P<0.01)。

表3 大豆肽對力竭運動大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 蛋白表達水平的影響(n=10)Table 3 Effects of SP on expression levels of LC3,Beclin-1and Atg7 mRNA in myocardial tissue of rats with exhaustive exercise(n=10)

圖2 大豆肽對力竭運動大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA表達水平的影響Fig.2 Effects of SP on expression levels of LC3,Beclin-1 and Atg7 mRNA in myocardialtissue of rats with exhaustive exercise注：1為正常對照組；2為力竭運動模型組；3為大豆肽 500 mg/kg組；圖3同。

2.4 大豆肽對力竭運動大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達水平的影響

如圖3,模型組中LC3、Beclin-1及Atg7蛋白條帶光密度增加;500 mg/kg大豆肽劑量組與模型組相比條帶光密度降低。如表3,與正常對照組比較,力竭運動模型組大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達水平極顯著上調(P<0.01);與模型組比較,大豆肽500 mg組大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達水平極顯著下調(P<0.01)。

圖3 大豆肽對力竭運動大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7蛋白表達水平的影響Fig.3 Effects of SP on expression levels ofLC3,Beclin-1 and Atg7 mRNAin myocardial tissue of rats with exhaustive exercise

3 討論

心臟血流動力學指標異常是力竭運動心臟病變的重要病理基礎,主要是由于心肌缺血缺氧產生大量的自由基、炎癥因子等有害物質,從而抑制心臟功能直至衰竭[12]。本研究發現大豆肽500 mg/kg可顯著降低力竭運動大鼠LVEDP,升高LV dp/dt max、LV dp/dt min、LVSP及MABP等血流動力學參數;同時大豆肽500 mg/kg可明顯改善力竭運動大鼠心肌組織的病理學變化,使心肌結構損傷減少,炎癥細胞浸潤降低。由此可知大豆肽對力竭運動大鼠心臟血流動力學有一定的改善作用,并能緩解心肌病理性損傷,提示其對心臟具有一定的保護作用,這與參考文獻[9]結果一致。

大豆肽500 mg/kg可極顯著降低力竭運動大鼠心肌組織LC3、Beclin-1及Atg7 mRNA和蛋白表達水平,提示大豆肽改善力竭運動大鼠心功能和血流動力學的作用機制與其抑制細胞自噬相關。研究報道,力竭運動導致的心肌缺血缺氧損傷可過度激活心肌細胞自噬,而自噬水平升高可誘發或加重心肌細胞損傷,降低心臟的舒縮功能,引發心律失常、心肌壞死及心功能障礙等疾病[13]。自噬是機體細胞為清除胞內衰老、損傷或壞死的蛋白質、代謝物和細胞器等而自發的一種保護性生物學行為,以此實現細胞本身的代謝需求和部分細胞器的更新[14]。但若細胞自噬行為過于激烈,使胞內蛋白質降解過多或使正常細胞器損傷,可誘發細胞自噬性死亡、凋亡或壞死等,從而導致組織器官損傷、功能障礙或疾病的發生[15]。

細胞在靜息狀態時,LC3以Pro-LC3形式存在,其C末端被Atg4水解暴露甘氨酸形成LC3Ⅰ,主要存在于胞漿中,當細胞被氧化應激等損傷因素刺激時自噬行為被激活,LC3ⅠC末端甘氨酸殘基與Atg7、Atg3活性位點形成硫脂鍵,促進LC3Ⅰ與磷脂結合即形成LC3Ⅱ,LC3Ⅱ穩定結合在自噬體膜上并不斷聚集,促進自噬體的形成,可見LC3Ⅱ的表達量與自噬程度或自噬體數量存在正比關系,所以可通過檢測LC3(LC3Ⅰ和LC3Ⅱ)的表達水平初步判斷細胞的自噬行為[16]。Beclin-1主要與PI3K形成復合體介導其他自噬蛋白(如Atg、LC3等)定位于自噬泡,從而啟動自噬,并參與和調控自噬體的形成與轉歸[17]。由此可見,在自噬發生的過程中,LC3、Beclin-1及Atg7等因子與之密切相關,調控自噬的發生發展。

綜上所述,大豆肽對力竭運動大鼠心臟功能、血流動力學及病理性損傷有一定的改善作用,其機制可能與抑制細胞自噬相關。