杜仲雄花超微粉碎破壁條件優化

魏媛媛,李偉業,溫 曉,于華忠

(吉首大學林產化學加工工程湖南省重點實驗室,湖南張家界 427000)

杜仲雄花,雌雄雙株,杜仲雄蕊的萌發先于杜仲新枝新葉,避免了在營養供給上與枝葉生長的矛盾,因此,杜仲雄花的營養物質豐富且全面。近幾十年,國內外學者對杜仲雄花茶中的天然活性物質和功效作用已進行大量研究。杜仲雄花富含次生代謝產物,主要有總黃酮、木質素類、苯丙素類、環烯醚萜類、三萜、甾類等,具有抗腫瘤、鎮靜催眠、降血壓、降血脂、抗疲勞、抑菌、抗氧化及抗衰老等作用[1-4]。目前市場上杜仲雄花相關產品主要以杜仲雄花茶為主,對杜仲雄花的活性成分不能最大化利用,因此考慮對杜仲雄花進行破壁,從而提高其活性成分的利用率。目前,破壁技術應用廣泛,在食品領域的應用范圍較小,在中藥加工和制藥工業方面研究和應用較多,主要以中藥破壁飲片和花粉破壁為主。

細胞破壁技術是采用一定的技術手段,破壞細胞外壁和內膜囊都,使其內容物在破壁后滲透而出,從而使有效成分易于被提取或吸收。破壁技術可分為物理法、生物法和化學法。超微粉碎是通過機械對物料的物理作用,將物料粉碎至微米級別。超微粉碎能有效減小物料粉體顆粒粒度,增加粉體的表面積和孔隙率,使超微粉末具有良好的吸附性、溶解性和分散性等多方面的理化新特性[5],有利于方便食品和速溶食品的加工,以滿足現代食品生產所需,此外,經超微粉生產的產品更容易被人體消化吸收[6-7]。因此,本研究采用響應面曲線法,以杜仲雄花的破壁率為指標,確定超微粉碎破壁杜仲雄花的最優條件,為杜仲雄花的綜合利用提供工藝基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲鮮雄花 2018年3月下旬采自湖南省張家界市慈利縣江埡林場,去除鮮葉和枝梗密封袋儲存于-10 ℃冰箱冷藏室,保存備用,湖南張家界慈利江埡茶葉合作社提供;蘆丁、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷等標準品 純度>99%,中國生物制品鑒定院;無水乙醇、甲醇等試劑 均為國產分析純。

振動式細胞級超微粉碎機 濟南達微機械有限公司;Nikon ECLIPSE E200光學顯微鏡 上海楚柏實驗室設備有限公司;Thermo Evolution 220型紫外可見分光光度計 上海輔澤商貿有限公司);Agilent 1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;XD-5200DT型超聲波清洗儀 南京先歐儀器制造有限公司;HH型數顯電熱恒溫水浴鍋 江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠;Hei-VAP value旋轉蒸發儀、SHZ-D(III)循環水式真空泵 鞏義市予華儀表有限責任公司;AL204型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;AEL-40SM型半微量天平 南京萊步科技實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超微粉碎破壁杜仲雄花工藝 低溫儲存的鮮雄花→真空干燥→粗粉碎→過篩→超微粉碎破壁。

操作要點:

真空干燥:稱取低溫儲存的杜仲鮮雄花36 g,薄層且均勻地攤放在半徑為15 cm的不銹鋼圓盤中,將其置于真空干燥箱中,在真空度為-0.1 Mpa,溫度為40 ℃下,對杜仲雄花鮮花進行干燥[8],間隔攪拌,并測定其水分,控制到實驗所需水分含量,備用;

粗粉碎:將真空干燥后的杜仲雄花進行粗粉碎,過100目篩,備用;

超微粉碎破壁:開啟超微粉碎機降溫系統,設置實驗溫度值,打開主機預熱30 min至機器達到正常運轉。稱量過100目篩的雄花物料裝罐,將物料罐裝機后設置粉碎時間,啟動粉碎機粉碎系統,粉碎完成后自動停止,取少量破壁后的物料進行破壁率的檢測。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 粉碎時間的篩選 取低溫冷凍室儲存的鮮雄花,真空干燥至水分4%,精密稱量100 g,分別粉碎1、2、4、6、8、10 min。通過顯微鏡下觀察其破壁率,得到在最短時間內達到最高破壁率的粉碎時間范圍。

1.2.2.2 投料量的篩選 投料量的篩選可根據超微粉碎儀器物料罐的大小和儀器使用注意事項以及雄花破壁率的高低來設定,取處理后超低溫冷凍室儲存的鮮雄花,真空干燥至水分4%,分別稱量100、120、140、160、180、200 g,粉碎6 min。(本實驗所用儀器的儲料罐的容量小于等于200 g),得到達到最高破壁率的投料量。

1.2.2.3 物料水分的篩選 取低溫冷凍室儲存的鮮雄花,通過真空干燥控制鮮雄花水分含量,分別干燥至水分含量為2%、4%、6%、8%、10%、12%,精密稱取各水分含量的雄花100 g,粉碎6 min。通過顯微鏡觀察其破壁率,得到達到最高破壁率的雄花水分范圍。

1.2.3 響應面實驗設計 為了使超微粉碎破壁杜仲雄花方法更加科學可靠,根據單因素實驗結果,選擇粉碎時間、投料量和雄花水分含量為影響因素,雄花破壁率為評價標準,利用Design-Expert 8.0.6軟件,根據Box-Behnken中心實驗組合設計實驗,因素水平設計見表1。

表1 實驗因素與水平Table 1 Factors and l evels in response surface test

1.2.4 破壁前后雄花有效成分對比

1.2.4.1 總黃酮含量測定 標準曲線的繪制:稱取干燥至恒重的蘆丁標準品12.0 mg于100 mL容量瓶中,加適量甲醇,置于40 ℃水浴微熱溶解,放冷至室溫,加甲醇至刻度,搖勻,即得質量濃度為12 mg·mL-1的蘆丁對照品母液,精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL,分別置于25 mL容量瓶中,各加水至6 mL,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法進行顯色:先加入5%亞硝酸溶液1 mL,混勻,放置6 min;后加入10%硝酸鋁溶液1 mL,搖勻,放置6 min;然后加入4%氫氧化鈉溶液10 mL,最后加水至刻度,搖勻,放置15 min,測定[9]。以蘆丁標準品為橫坐標,吸光度值為縱坐標,得蘆丁的標準曲線方程為C=0.01185A-0.00333,R2=0.99996。蘆丁在4.8～28.8 μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

1.2.4.2 桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷含量測定 色譜條件:Thermal Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 um);以0.3%磷酸溶液為流動相A,乙腈為流動相B,按下表1中的規定梯度洗脫,體積流量1.0 mL·min-1;柱溫26 ℃;多波長檢測:206、238、327 nm;檢測時間為25 min,進樣量為20 μL。

表2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

表3 3種活性成分線性回歸方程Table 3 Linear regression equation of Three active ingredients

標準曲線的繪制:分別精密稱取桃葉珊瑚苷對照品京尼平苷8.02 mg,綠原酸對照品7.88 mg,京尼平苷對照品4.33 mg,置同一5 mL棕色量瓶中,超純水定容,搖勻,即得。分別精密吸取混合對照品溶液0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL定容至10 mL容量瓶中,再經0.45 μm微孔膜濾過,依次進樣20 μL測定其峰面積。分別以對照品濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,進行線性回歸,得回歸方程。回歸方程與線性范圍見下表3。結果表明,桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷對照品濃度與色譜峰面積線性關系良好。

1.2.5 破壁率的計算 配制4%的花粉液,制作玻片,直接顯微鏡下觀察。

取破壁后的杜仲雄花粉末(超微粉碎破壁和和破壁前相同雄花粉末作為對照)各0.5 g,加入12.5 mL蒸餾水,制作玻片;直接吸取攪拌均勻的破壁處理液,制作玻片;將制作好的玻片置于10×40目的顯微鏡下觀察。每種破壁處理液觀察3～4個玻片,每個玻片取3個視野,統計計算[10]。按下式計算花粉的破壁率:

破壁率(%)=視野中已破壁雄花粉末粒數/同視野總雄花粉末顆粒數×100

1.3 數據處理

每組實驗重復三次,試驗數據使用SPSS Statistics 24軟件進行分析,使用wps 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 粉碎時間對超微粉碎破壁率的影響 由圖1可見,超微粉碎時間對其破壁率有一定影響,隨粉碎時間的加長,破壁率越高,但2 min后其破壁率差異不大,到8 min破壁率可達100%,粉碎時間越長,超微粉轉子與物料的摩擦幾率越大,雄花粉碎越徹底[11]。粉碎至6 min左右破壁率基本變化不明顯,因此最佳粉碎時間為2～8 min。

圖1 不同粉碎時間對雄花破壁率的影響Fig.1 Effect of different grinding time on wall breakingrate of Eucommia ulmoides male flower

2.1.2 投料量對超微粉碎破壁率的影響 超微粉碎投料量的多少與超微粉碎機的性能密不可分[12]。如圖2所示,隨投料量的增加,破壁率先升高后降低。原料投放量至物料罐的2/3(160 g)處最佳。投料量少于物料罐的1/3(100 g)會對機器轉子損傷較大,投料量過多,原料易堆積[13],從而影響雄花粉碎程度,因此超微粉破壁雄花最佳投料量為100～200 g。

圖2 不同投料量對雄花破壁率的影響Fig.2 Effect of different dosageon Eucommia ulmoides male flower wall breaking rate

2.1.3 雄花水分含量對超微粉碎破壁率的影響 由圖3可見,雄花水分含量對超微粉碎破壁率有一定影響,隨雄花水分含量的升高,破壁率呈先升高再降低的趨勢。水分含量在3%～9%左右,破壁率達到最大。水分過低或過高,超微粉轉子與物料的摩擦力減小,破壁率較低。因此最佳粉碎雄花水分含量為3%～9%左右。物料水分含量越高,由于物料粉碎倉內溫度和物料停留時間的影響,使得物料水分不能完全蒸發,且蒸發的水蒸氣不能及時排出,必然造成粘轉子、粘壁和減小轉子摩擦力等現象,不但降低了粉碎效果,而且破壞了物料在粉碎倉內的平衡狀態[14]。

圖3 雄花不同水分含量對其破壁率的影響Fig.3 Effect of Different Water Contenton Wall Breaking Rate of Eucommia Ulmoides Male Flower

2.2 響應面分析

表5 回歸方程方差分析表Table 5 Variance analysis of regression equation

2.2.1 二次多元回歸模型分析 響應面實驗設計結果見表4。對試驗所得的數據進行多元化回歸擬合分析得到3個因素與雄花破壁率之間二次回歸模擬方程為:

Y=99.44+8.85A-2.17B-3.10C+1.02AB+4.43AC+0.53BC-6.51A2-1.21B2-3.11C2

回歸方程顯著性檢驗及方差分析結果見表5。二次回歸模擬方程其中一次項和二次項都有顯著性影響因素,所以實驗各因子對響應值的影響并不是線性關系。

表4 Response surface中心組合方案及響應值Table 4 Response surface central combinationproject and response values

響應面圖可以直觀地觀察各影響因素之間的相互關系,響應曲面圖形越陡峭,即其交互作用越顯著,圖形平穩則說明交互作用比較微弱。兩因素交互作用對超微粉破壁杜仲雄花破壁率影響的響應曲面見圖3,粉碎時間和雄花水分含量交互作用最強,即對破壁率的影響最為顯著;投料量和雄花水分含量交互作用最弱。由圖3可見,當粉碎時間為8 min左右,投料量為100 g左右時,超微粉破壁杜仲雄花破壁率達到100%;雄花水分含量在3%左右,粉碎時間為8 min左右,超微粉破壁杜仲雄花破壁率可達100%;雄花水分在3%左右,投料量為100 g左右時,超微粉破壁杜仲雄花雄花破壁率可達100%。

圖3 各兩因素交互對超微粉破壁杜仲雄花破壁率的影響Fig.3 Effect of interaction of two factors on the wall-breakingrate of ultrafine powder broken Eucommia ulmoides male flowers

圖4 杜仲雄花破壁前后顯微鏡視野圖Fig.4 Microscopic field of view of Eucommia ulmoides male flowers before and after wall breaking

2.2.2 最優條件確定以及驗證 通過響應曲面法分析得到最大響應值(Y)時,調整后A、B、C對應的值分別為A=8 min,B=100 g,C=6%。為檢測響應曲面法所得結果的可靠性,進行驗證試驗,破壁率為100%,采用優化條件,實驗值與預測值相對誤差RSD為1.69%。

2.3 超微粉破壁杜仲雄花前后顯微鏡視野對比

不同破壁方法對雄花細胞破壁方式不同,因此顯微鏡下視野狀態不同。由下圖4中超微粉碎破壁雄花顯微鏡視野圖可見,雄花細胞呈碎末狀、碎片狀等,由此可見超微粉碎破壁是通過物料與介質的混合振動,并受到強烈的振動、沖擊、剪貼、撕扯等作用,從而達到破壁效果。

2.4 超微粉破壁杜仲雄花前后有效成分含量對比

杜仲雄花破壁前后提取成分含量對比見表6,由表6可見,破壁后杜仲雄花中的總黃酮、桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷溶出率均明顯高于破壁前,破壁后的杜仲雄花總黃酮含量為2.59%,比破壁前高出60%多。由此可見,應用超微粉碎破壁杜仲雄花細胞壁有利于活性成分的溶出。

表6 雄花破壁前后成分對比Table 6 Comparison of components of Eucommia ulmoidesmale flowers before and after wall breaking

3 結論

應用響應面分析法對試驗結果和數學模型進行分析,結果顯示,回歸模型呈現高度顯著(P<0.0001),失擬項不顯著,可知回歸方程的擬合度和可信度均較高,能夠很好預測各條件下超微粉破壁杜仲雄花的破壁率。從F值的分析結果可以看出,在所選的各因素水平范圍內,粉碎時間對雄花破壁率的影響最大;由響應曲面法分析得到最大響應值(Y)時,破壁條件:粉碎時間8 min,投料量為100 g,雄花水分含量為6%,其破壁率可達100%,驗證試驗可靠。杜仲雄花破壁前后顯微鏡視野圖表明超微粉具有很好的破壁作用,改善了杜仲雄花細胞壁的通透性,有利于其有效成分的溶出,為杜仲雄花的應用提供可靠依據。