即食米面制品中蠟樣芽胞桿菌分離鑒定及毒力基因研究

張明明,梁美丹,肖 劍,張彬彬,蔣佳希,宋安華

(廣州市食品檢驗所,廣東廣州 510410)

蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)是芽胞桿菌屬的一種兼性需氧、有芽胞、無莢膜、能運動的革蘭氏陽性菌,廣泛分布于土壤、灰塵和污水中,是食品中常見污染菌和條件致病菌之一[1]。其所致中毒癥狀主要表現為腹瀉和嘔吐,引起的食物中毒事件往往比較嚴重。B.cereus極易污染含蛋白質和碳水化合物豐富的食品,特別是包括米飯、面條和糕點在內的即食米面制品等[2-4]。

近年來,我國各省市地區由蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒事件時有報道。研究發現,在由蠟樣芽胞桿菌引發嘔吐型食物中毒的食品中,糧食加工品占很大的比例,其中米飯及其制品約占81.1%,面制品約占10.1%,在致瀉型食物中毒中糧食加工品占約30%的比例[5]。而即食米面制品因其營養豐富、直接食用等特點,在加工制作、運輸、銷售過程中更易受病原微生物的污染。由此可見,探究即食米面制品中蠟樣芽胞桿菌的污染情況及其毒力基因攜帶情況與食品安全和消費者的健康息息相關。B.cereus引起的食物中毒與其攜帶的毒力因子所產生的毒素密切相關。腹瀉型毒素是引起腹瀉的最主要原因,腹瀉型毒素是一種多元化毒素,目前鑒定出與其相關的毒力因子主要包括溶血素BL基因(hbl)、非溶血性腸毒素Nhe基因(nhe)、細胞毒素K基因(cytK)、腸毒素T基因(bceT)和腸毒素FM 基因(entFM)等[6-10]。溶血素BL基因是位于染色體上的一個共轉錄操縱子,通常由hblA、hblB、hblC、hblD四個基因組成,也有的缺失hblB基因,只由hblA、hblC、hblD三個基因組成。編碼非溶血性腸毒素Nhe的三個基因位于質粒上,分別是nheA、nheB、nheC。B.cereus嘔吐毒素cereulide是一種環形的小分子肽,抗熱性強,對各種物理和化學因素不敏感,一般的食品加工過程無法將其破壞,引發食物中毒,并伴有嘔吐癥狀。目前,針對嘔吐型B.cereus毒力基因檢測的目標基因有ces、cer和EM1[11-12]。另外,B.cereus的持家基因groEL、gyrB、rpoB、vrrA在所有菌株中均可檢出,可用于菌株的輔助鑒定[13-14]。B.cereus引起的食物中毒事件在國內外均有報道,中毒后還可能導致胃腸功能紊亂,各種局部或全身性感染,如壞死性腸炎、肝功能衰竭,菌血癥和腦膜炎[15-16]。

本研究以從餐飲服務場所采集了包括盒飯、米飯、粉面、餃子及花卷在內的245份即食米面制品樣品,從中分離鑒定得到食源性B.cereus陽性菌株。采用PCR方法對B.cereus陽性菌株的13種毒力基因進行檢測,旨在了解該地區即食米面制品中B.cereus的污染狀況,探究這些毒力基因在食源性蠟樣芽胞桿菌中的分布規律,掌握該地區食源性蠟樣芽胞桿菌的流行病學特征,為該病原菌的監控、預警及爆發引起食物中毒后追蹤其感染源和傳播途徑及構建基因指紋圖譜庫和分子溯源平臺提供實驗數據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟樣芽胞桿菌標準菌株CICC 10352 中國工業微生物菌種保藏中心;大腸埃希氏菌ATCC 25922、甘露醇卵黃多黏菌素(MYP)瓊脂平板、蠟樣芽胞桿菌生化鑒定盒、革蘭氏染色試劑盒 廣東環凱生物科技有限公司;低熔點瓊脂糖 德國SIGMA公司;DL 2000 Marker 寶生物工程(大連)有限公司;GeneGreen核酸染料、2x Taq PCR MasterMix 北京天根生化科技有限公司;PCR引物 華大基因合成。

1300系列A2型超凈工作臺 Thermo Fisher Scientific公司;SHP-250型培養箱 廣東環凱生物科技有限公司;GR85 DR型滅菌鍋 ZEALWAY儀器公司;DM2500相差顯微鏡 Leica儀器有限公司;ME204型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;C1000 Touch PCR儀、水平電泳系統、Gel Doc XR+凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司;HNDKT 200-2型恒溫金屬浴 上海漢諾儀器有限公司;1-14K冷凍離心機 德國SIGMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 即食米面制品樣品的采集 于2016～2018年從廣州市市場餐飲服務場所采集不同即食米面制品樣品共245份,樣品包括:盒飯204份,米飯21份,粉面18份,餃子1份,花卷1份。采集的樣品當天送入實驗室進行分離培養。

1.2.2 蠟樣芽胞桿菌的分離與培養純化 所有采集樣品均在無菌條件下進行處理。按照GB 4789.14-2014《食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》[17]進行檢驗。

1.2.3 細菌基因組DNA的制備 細菌基因組DNA通過煮沸法制備。煮沸法提取細菌基因組DNA步驟如下:使用1 μL接種環刮取營養瓊脂或斜面上培養18～24 h的菌落于200 μL 0.85%滅菌生理鹽水中,打散制成菌懸液,13000 r/min離心3 min,棄去上清;加入1 mL滅菌去離子水充分混勻菌體,100 ℃金屬浴10 min;冷卻后13000 r/min離心3 min,收集上清作為PCR檢測模板。

1.2.4 PCR引物 蠟樣芽胞桿菌4個持家基因和13個毒力基因的特異引物序列及擴增片段大小見表1。所有文獻引用的參考引物均用DNASTAR Lasergene軟件進行驗證。

表1 蠟樣芽胞桿菌持家基因及毒力基因檢測引物Table 1 Primers for detection of virulence genes and house-keeping genes in B.cereus

1.2.5 蠟樣芽胞桿菌攜帶持家基因和毒力基因的檢測 利用蠟樣芽胞桿菌不同持家基因及毒力基因引物進行PCR 擴增。

反應體系:總體積為25 μL,2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,超純水8.5 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,菌株DNA模板2 μL,空白對照組用無菌超純水補足至25 μL。

PCR反應程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,不同退火溫度30 s,72 ℃ 1 min,30個循環,72 ℃ 10 min。以0.5×TBE為電泳緩沖液,在100 V電壓下對PCR 擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳,并利用凝膠成像系統檢測。

1.3 數據處理

數據處理及分析采用SPSS 15.0軟件。

2 結果與分析

2.1 即食米面制品中蠟樣芽胞桿菌的分離與初步鑒定

由于蠟樣芽胞桿菌不能利用D-甘露醇不產酸,在MYP選擇培養基酚紅指示劑作用下,菌落形態為典型的粉紅色。蠟樣芽胞桿菌產生卵磷脂酶,在MYP培養基中卵黃乳液作用下,會在菌落周圍產生2～5 mm沉淀環,菌落較大,表面比較干燥。通過生化鑒定、根狀生長試驗和蛋白質毒素結晶試驗判定蠟樣芽胞桿菌陰陽性。本研究245份即食米面制品樣品中檢出26份樣品蠟樣芽胞桿菌呈陽性,檢出率為10.61%(26/245),陽性檢出樣品主要為盒飯及米飯,在粉面中僅檢出陽性樣品1份,餃子及花卷中未出現陽性樣品。陽性樣品中蠟樣芽胞桿菌平均檢出量為3032 CFU/g,詳見表2。由表2可以看出,幾種不同類型的即食米面制品樣品中盒飯的陽性率10.29%基本與樣品總體陽性率10.61%持平,其蠟樣芽胞桿菌的平均檢出量4010 CFU/g,明顯高于其他幾類樣品,且其最大檢出量41000 CFU/g已接近于可能引發食物中毒的105CFU/g蠟樣芽胞桿菌含量。

2.2 蠟樣芽胞桿菌持家基因及毒力基因鑒定

對分離得到的蠟樣芽胞桿菌陽性菌株進行4個持家基因groEL、rpoB、gyrB、VrrA的檢測,結果表明陽性分離菌株的4個持家基因檢出率均為100%,進一步確認陽性分離菌株為蠟樣芽胞桿菌。部分蠟樣芽胞桿菌分離菌株4個持家基因的PCR產物電泳圖見圖1。

表2 即食米面制品中蠟樣芽胞桿菌檢出狀況Table 2 Detection level of B.cereus in ready-to-eat products of rice and wheat

圖1 部分蠟樣芽胞桿菌分離菌株持家基因PCR產物電泳圖Fig.1 The electropherograms of PCR products ofhouse-keeping genes form parts of B.cereus isolates注:M:DL 2000 Marker;1:試劑空白;2:提取空白;3:陽性對照(蠟樣芽胞桿菌CICC 10352);4:陰性對照(大腸埃希氏菌ATCC 25922);5～9:蠟樣芽胞桿菌分離菌株BC-1～BC-5;A～D:groEL、rpoB、gyrB、VrrA基因圖譜。

結果表明從26份陽性樣品中共篩選得到49株蠟樣芽胞桿菌菌株。對這49株陽性菌株進行毒力基因檢測,結果詳見表3。由表3可知,49株陽性分離菌株均檢出兩種或者兩種以上的毒力基因,即分離菌株的毒力基因攜帶率為100%,且均為復合型毒素攜帶菌株。菌株BC-36攜帶的毒力基因數量最少,為2種(nheB和nheC),陽性菌株中共有6株檢出最高的毒力基因攜帶數量9種,檢出攜帶4種毒力基因的菌株數量占所有陽性菌株的比例最高,為22.45%(11/49)。在檢測的10種腹瀉型毒力基因中,非溶血性腸毒素基nheB和nheC的檢出率最高,均達到95.92%(47/49),其次為腸毒素基因entFM和nheA,檢出率分別為91.84%(45/49)和73.47%(36/49),4個溶血素BL基因檢出率分別為hblA20.41%(10/49)、hblB8.16%(4/49)、hblC38.78%(19/49)和hblD40.82%(20/49),腸毒素基因becT和細胞毒素基因cytK的檢出率分別為30.61%(15/49)和40.82%(20/49)。三種嘔吐型毒力基因ces、cer、EM1檢出率較低,均為4.08%(2/49),僅有菌株BC-37及BC-43檢出,檢出的這2株陽性菌株均含有這三種毒力基因。經過陽性對照實驗發現,參考菌株CICC 10352中檢測出nheA、nheB、nheC、entFM基因和四個持家基因。

表3 蠟樣芽胞桿菌分離菌株毒力基因分布Table 3 The distribution of virulence genes of isolated B.cereus

續表

注:“+”表示檢出陽性,“-”表示檢出陰性;表格欄“來源”命名規則為“樣品類型-年份-編號”,“HF”代表盒飯樣品,“FM”代表粉面制品樣品,“MF”代表米飯樣品;如“HF-18-1”代表陽性菌株BC-1來源于2018年采集的盒飯樣品01號。

從表3顯示的數據進一步分析發現蠟樣芽胞桿菌毒力基因攜帶模式共有26 種,說明即使米面制品中分離的蠟樣芽胞桿菌呈現遺傳多樣性。其中44.90%(22/49)的蠟樣芽胞桿菌攜帶hbl基因,同時攜帶hblA、hblC和hblD的蠟樣芽胞桿菌共有9株,其中同時攜帶hbl4個基因的菌株共有4株,說明hblB基因存在著部分缺失。檢測發現所有的陽性菌株均攜帶nhe基因,nheB和nheC均具有最高的檢出率95.92%,nheA檢出率(73.47%)略低于前二者,71.43%(35/49)的蠟樣芽胞桿菌同時攜帶nheA、nheB和nheC。91.84%(45/49)的蠟樣芽胞桿菌同時攜帶nhe和entFM基因,檢出率相對較高,說明非溶血性腸毒素nhe基因、entFM基因是分離菌株的主要毒力基因。既攜帶nhe3個基因同時又攜帶hblA、hblC和hblD基因的菌株有7株,占14.29%(7/49),且這7株菌均含有entFM基因,屬強毒株。嘔吐型毒力基因ces、cer、EM1僅在菌株BC-37及BC-43中檢出,其檢出率(4.08%)遠低于腹瀉型毒力基因;檢出的這2株陽性菌株均含有這三種毒力基因,同時攜帶nheC及entFM。針對于nheB基因的檢測發現,除去檢出嘔吐型毒力基因ces、cer、EM1的菌株BC-43及BC-49之外的其他陽性菌株均檢出nheB陽性。

從樣品來源分析,有多種不同毒力基因攜帶模式的蠟樣芽胞桿菌分離自同一樣品:攜帶四種不同毒力基因型的陽性菌株BC-4、BC-5、BC-6及BC-7均分離純化自樣品“HF-17-2”,說明蠟樣芽胞桿菌遺傳存在多樣性。同一份樣品中存在著多種毒力基因型的菌株說明樣品來源環境較為復雜,相較于米飯、餃子等無需多次混裝的樣品,盒飯由于其米飯、菜等多次混裝的過程增加了其蠟樣芽胞桿菌污染的風險。比較于米飯、粉面等樣品檢出的毒力基因型,由盒飯檢出的毒力基因型種類明顯較多。

3 結論和討論

本研究從餐飲服務場所采集包括米飯、粉面、餃子及花卷在內的245份即食米面制品,蠟樣芽胞桿菌的檢出率為10.61%(26/245),陽性檢出樣品主要為盒飯及米飯,在粉面中僅檢出陽性樣品1份,餃子及花卷中未出現陽性樣品。陽性樣品中蠟樣芽胞桿菌平均檢出量為3032 CFU/g,其中以盒飯的檢出程度最高。從即食米面制品中分離得到的蠟樣芽胞桿菌菌株攜帶的13種毒力基因進行調查,每株均檢出兩種或兩種以上的毒力基因,發現腹瀉型毒力基因nhe和entFM為主要毒力基因。

本研究中蠟樣芽胞桿菌的檢出率與劉勛等[21]對郴州市餐飲服務環節和流通環節即食食品食源性致病菌污染狀況調查中熟制米面制品蠟樣芽胞桿菌的檢出率16.33%、倪剛等[22]在對紅河州食源性蠟樣芽胞桿菌研究中發現米面制品中蠟樣芽胞桿菌的檢出率為13.5%比較接近。在多起蠟樣芽胞桿菌食物中毒事件中,被污染的食品主要為剩米飯(44.6%)和開水泡飯(17.0%)[23]。我國相關食品的標準中沒有明確蠟樣芽胞桿菌的殘留限量規定值,對該菌的要求大多是按照進食污染菌量>105CFU/g的食物時就可能發生食物中毒[24]的標準進行檢驗控制。但是在夏季,米飯和涼拌食品如涼面、涼皮等原料本身容易被蠟樣芽胞桿菌污染。王彤等[25]的研究表明溫度對蠟樣芽胞桿菌含量及毒素的產生有直接的相關性,在一定范圍內的高溫環境中,溫度越高引起食物中毒的風險越大,應當給予重視。本研究中盒飯及米飯中的蠟樣芽胞桿菌檢出率較高;與米飯相比,盒飯中蠟樣芽胞桿菌的平均檢出量高出一個數量級,且其檢出范圍更寬,最大檢出量接近于可能引發食物中毒的105CFU/g含量值,這可能與盒飯的制作過程先處理再多次混裝有關,多次混裝的過程增加了蠟樣芽胞桿菌等致病菌對食品的污染風險。由此可知,需加強對以盒飯為主要經營方式的快餐店,尤其是網絡快餐店的食品安全風險監測。

蠟樣芽胞桿菌的致病性與其攜帶的毒力基因直接相關,了解食源性蠟樣芽胞桿菌主要毒力基因型,有助于掌握食源性蠟樣芽胞桿菌的流行病學特征。對分離的49株蠟樣芽胞桿菌所攜帶的毒力基因進行檢測發現,僅菌株BC-37及BC-43中檢出嘔吐型毒力基因ces、cer、EM1,檢出率(4.08%)較低,與Kim等[26]及Wijnands等[27]的研究結果基本一致。所有分離的蠟樣芽胞桿菌中44.90%(22/49)菌株攜帶hbl基因,同時攜帶hblA、hblC和hblD的蠟樣芽胞桿菌共有9株,有研究[28]表明只有當菌株含有hblA、hblC、hblD全部三個毒力基因時,該菌株才會產生溶血毒素BL,說明這9株蠟樣芽胞桿菌是可以產生溶血毒素BL,對消費者會產生危害。此外,檢測發現所有的陽性菌株均攜帶非溶血腸毒素nhe基因,其中35株蠟樣芽胞桿菌同時攜帶nheA、nheB和nheC,表明分離到的所有蠟樣芽胞桿菌中有71.43%(35/49)的菌株能夠發揮非溶血性腸毒素的強致腹瀉功能。91.84%(45/49)的蠟樣芽胞桿菌同時攜帶nhe和entFM基因,檢出率相對較高,說明非溶血性腸毒素nhe基因、entFM基因是分離菌株的主要毒素基因,與李文涓等[29]、章樂怡等[30]等研究結果一致。既攜帶nhe3個基因又攜帶hblA、hblC和hblD基因的菌株有7株,占14.3%(7/49),且這7株菌均含有entFM基因,屬強毒株。如果消費者不小心攝入了被上述蠟樣芽胞桿菌污染的食品,引起食物中毒的風險較大,且產生腹瀉等不良反應的可能性高于嘔吐等不良反應。但是Cai等[31]等在對蠟樣芽胞桿菌基因組及基因多樣性分析時發現由nheA、nheB和nheC轉錄翻譯的NHE蛋白并未參與形成腹瀉癥狀,這有待進一步的研究證實。通過本研究獲得的結果對該病原菌的監控、預警及爆發引起食物中毒后追蹤其感染源和傳播途徑及構建基因指紋圖譜庫和分子溯源平臺具有指導意義。