聚合酶鏈式反應分析儀（PCR儀）校準裝置的研究與設計

魏 群，呂 丹，陳海凌

（1 福建省計量科學研究院，福建 福州 350003）

（2 人民解放軍91370部隊，福建 福州 350015）

1 概述

聚合酶鏈式反應分析儀（Polymerase Chain Reaction Analyzer,簡稱“PCR儀”）可提供制定的溫度場，在該環(huán)境下DNA聚合酶發(fā)生復制進行擴增[1]。PCR技術具有極高的檢測靈敏度和特異性，可廣泛用于臨床醫(yī)學等的診斷和療效觀察，在器官移植的基因配型上作用是難以替代的。目前市場上的PCR儀有梯度PCR儀、實時熒光定量PCR儀、原位PCR儀和定性PCR儀等。常規(guī)的多通道溫度檢測方法，比如帶熱電偶或帶熱電阻傳感器的溫度巡檢儀，在（0～100）℃測溫范圍內的最大示值誤差能達到±0.3℃。但此類測溫儀器由于傳感器的結構與擴增儀孔板不能完全緊密接觸，導致測溫結果的準確度不能滿足校準要求[2]。

目前，國內對聚合酶鏈式反應分析儀的溫度計量還處于起步階段，國內市場上的專業(yè)聚合酶鏈式反應分析儀溫度校準裝置還是空白，各計量檢測單位多采用溫度巡檢儀或國外的檢測系統(tǒng)，如荷蘭Driftcon公司的無線PCR儀溫度校驗系統(tǒng)和美國OPULUS公司的溫度巡回檢測裝置等。這些檢測裝置也存在一些問題。

（1）現(xiàn)有裝置所配置的傳感器只可適用于固定形狀的PCR儀，或通道數(shù)固定，無法滿足各類PCR儀的多樣校準需求。

（2）某些裝置是采用傳統(tǒng)的溫度巡回檢測方法來實現(xiàn)溫度測量，多通道測量時每通道的數(shù)據采樣時間長，無法反應PCR儀的實時溫度，也就無法實現(xiàn)溫度超調和升降溫速率的功能。

（3）價格昂貴，國外設備多在（30-40）萬/套。

2 PCR儀自動校準裝置的設計需求

2015年，原國家質檢總局正式發(fā)布了JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應分析儀校準規(guī)范》[3]，該規(guī)范推薦了使用的測溫點布置方式（15點校準與位置分布，如圖1所示）、校準設備和標準物質、軟件溫控程序數(shù)據讀取的基本順序、誤差計算與校準結果表達方式等。

圖1 15點校準位置布點

因此，根據JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應分析儀校準規(guī)范》和PCR儀校準裝置的存在問題，文中認為可以從以下三方面進行方案改進。

（1）設計一套專用自動化裝置，配置觸摸屏，支持至少15通道的高精度溫度傳感器的實時顯示和記錄、分析、處理；

（2）信號高速傳輸，每路數(shù)據采樣頻率大于2次/秒；

（3）設計一套自動校準軟件系統(tǒng)，包括數(shù)據采集、數(shù)據處理和數(shù)據報表等功能，數(shù)據采集將終端數(shù)據采集至上位機，數(shù)據處理包括溫度示值誤差、溫度均勻性、升降溫速率等，數(shù)據報表包括聚合酶鏈反應分析儀校準原始記錄的所有內容。

3 PCR儀自動校準裝置的設計

PCR儀自動校準裝置需采集多路溫度傳感器信號，顯示并處理相關數(shù)據，總體框架如圖2所示。多路溫度傳感器采用熱敏電阻，采集PCR儀不同位置反應孔的溫度信號，由片通電路實現(xiàn)各傳感器的選通，每個傳感器采樣速率不小于2次/秒；溫度信號經過信號轉換模塊由電阻信號轉換為電壓信號，并經過A/D轉換進入MCU處理；MCU在觸摸屏顯示實時數(shù)據以及處理結果等，并可通過外擴輸出數(shù)據；由按鍵控制裝置的開啟與關閉；由電源模塊為傳感器、MCU、觸摸屏、外擴等供電，其未在圖中畫出；測試完成后，可由外擴設備將數(shù)據發(fā)至上位機軟件進行數(shù)據處理等。

圖2 硬件框架圖

3.1 微處理器MCU

微處理器采用意法STM32F4系列，具有如下優(yōu)點：集成ARM Cortex-M4內核，主頻180MHz，高達2MB的片上雙庫Flash存儲器，具有突出的高性能、高速數(shù)據傳輸能力和豐富的外部器件擴展和通信總線，以及杰出的能耗效率，適用于電池供電情況。

3.2 溫度傳感器

溫度傳感器采用熱敏電阻，具有體積小、靈敏度高、反應速度快、分辨率高等優(yōu)點，其缺點在于非線性，而文中采用的核心控制芯片提供大容量的數(shù)據存儲空間，可完整記錄該溫度-阻值對應表，因此選擇熱敏電阻作為測溫元件。

3.3 片選模塊

利用移位寄存器74HC595級聯(lián)電路來實現(xiàn)傳感器選通設計，如圖3所示。74HC595是一個8位串行輸入、可串行或并行輸出的移位寄存器存儲寄存器和三態(tài)輸出。該設備具有串行輸入（DS）和串行輸出（Q7）來級聯(lián)和異步復位輸入的功能。在移位寄存器時鐘（SHCP）上升沿時，DS上的數(shù)據會被移入移位寄存器，在存儲寄存器時鐘（STCP）上升沿時，移位寄存器里的數(shù)據傳輸?shù)酱鎯拇嫫鳎斴敵鍪鼓躉E為低時，存儲寄存器里的數(shù)據就會并行輸出。

圖3 片選電路

3.4 外擴模塊

文中數(shù)據外擴采用WiFi和USB兩種模式。

WiFi利用ESP-12F WiFi模塊實現(xiàn)，該模塊支持標準的IEEE802.11 b/g/n協(xié)議，完整的 TCP/IP協(xié)議棧。用戶可以使用該模塊為現(xiàn)有的設備添加聯(lián)網功能，也可以構建獨立的網絡控制器。內置Tensilica L106超低功耗32位微型MCU，主頻支持80MHz和160MHz，支持RTOS。深度睡眠保持電流為10uA，關斷電流小于5uA，2ms之內喚醒、連接并傳遞數(shù)據包。待機狀態(tài)消耗功率小于1.0mW。電路連接圖如圖4所示。

圖4 WiFi電路連接圖

另設USB輸出，電路如圖5所示。

圖5 15 USB輸出電路

3.5 自動校準軟件

校準數(shù)據可通過外擴設備發(fā)至上位機軟件進行數(shù)據處理等，軟件界面如圖6所示，用彩色線條描繪多通道溫度實時數(shù)據，直觀反映被校PCR儀的實時波動情況。

圖6 軟件界面

4 試驗驗證

文中采用PCR儀自動檢定裝置校準某品牌PCR儀，根據JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應分析儀校準規(guī)范》設置采樣點和升降溫程序等，測量結果如表1所示，測試結果符合預期。

表1 測試結果

5 結論

目前PCR儀檢定過程中存在一些問題：數(shù)據采樣時間長，傳感器無法準確反應PCR儀實際工作情況；價格昂貴且模式固定，無論從價格還是實用性兩方面都不適用于國內現(xiàn)有的PCR儀校準。因此，文中針對這些存在的問題提出PCR儀校準裝置的設計方案，并介紹了硬件實施方案，通過試驗驗證可以發(fā)現(xiàn)該裝置的設計符合預期。