PCR技術在食品微生物檢測中的應用

曹歡歡

朝陽市檢驗檢測認證中心 遼寧朝陽 122000

PCR技術主要是通過聚合酶鏈式反應來對食品微生物進行檢測，當前有了較為廣泛的應用，己經成為食品微生物檢測的主要手段之一。通過PCR技術，能夠讓食品微生物檢測的精準程度及效率得到提升，最大化地保障了人民群眾的飲食安全。

1 PCR技術概述

1.1 常規PCR檢測原理

在常規PCR檢測的過程中，必須按照DNA模板作為緩沖液，利用DNA的聚化酶催化增加寡核苷酸的片段，形成完整的生物周期循環模型樣片，保證檢測的效果更加精確。常規PCR沙門氏菌檢測總檢出率大約為99．8%，能夠對630株沙門氏菌以及100多種血清進行準確檢測。

1.2 多重PCR檢測技術的概述

PCR中文名稱為聚合酶鏈式反應，其主要是指在體外條件下，模板DNA在聚合酶的作用下進行復制的技術，其過程主要為變性、退火與延伸。雙鏈DNA通過熱變性會形成單鏈DNA，然后其和引物進行結合，受到聚合酶的作用，核苷酸順著DNA單鏈逐漸延伸最終形成雙鏈，再將其當作模板產生新的DNA雙鏈，如此不斷循環。總體來說，多重PCR在某一反應體系之中加入超過兩對引物（包括兩對），從而產生更多的DNA序列[1]。

1.3 巢式PCR

巢式PCR能夠利用兩種不同的引物最DNA檢測片段進行擴充，利用第1套引物擴張15-30個基因循環，然后根據DNA片段設定第2套引物，同樣擴增15-30個循環，第2套引物即為內引物。通過超巢式PCR能夠全面增強反應的特異性，也能夠增強物異性和敏感性，對微生物的檢測和DNA的擴增具有非常明顯的效果。

通常情況下，巢式PCR技術在第1次擴張中必須打開反應管，然后除去第2套引物才能夠增加第2套引物，所以巢式PCR自身的操作非常復雜。利用巢式PCR技術可以確保外引物的溫度明顯上升，并且直接將兩套引物同時增加到PCR反應之中，如果內引物不能夠繼續結合，則形成雙霉鏈，確保整個引物反應系統穩定性增強。在引物擴增完畢后才能夠進入低火溫皮下循環，在低溫作用下內隱物會開始工作，如此的反復循環能夠快速的降低變性溫度，避免巢式PCR在循環的過程中產生產物檢驗。

2 PCR技術在食品微生物檢測中的應用檢測

2.1 檢測大腸桿菌檢

大腸桿菌具備一定的毒素，并且這類毒素還有著一致性，采取傳統的血清法微生物檢測方式不能夠對其進行準確的檢測。通過PCR技術，能夠有效檢測出大腸桿菌。與傳統檢測技術不同，PCR技術主要是對大腸桿菌的DNA雙鏈進行檢測，很大程度上保證了檢測的準確性。同時，部分技術人員將免疫磁分離技術與PCR技術相結合，在牛肉之中成功檢測到了大腸桿菌，并通過stx，、stx2、hly等基因來對大腸桿菌的類型進行了分析。

2.2 檢測沙門氏菌

在對食品進行制作與加工時，會讓其中所含有的沙門氏菌含量減少，故而沙門氏菌在食品中的含量相對較少，在這樣的背景之下，檢測食品中的沙門氏菌就具備較高的難度。通過PCR技術進行檢測，一般選擇iNVA、B、C、E等特異性引物，來建立多重的PCR。從檢測結果能夠看出，一重、二重PCR之間并未存在著較大的差異，但采用三重PCR則相對來說更為準確[2]。

2.3 檢測金黃色葡萄球菌

一般檢測法是檢測食品中金黃色葡萄球菌最常用的一種方法，首先，在無菌的環境下采取二十五克樣品食物，然后加入適當含量的氯化鈉肉湯，攪拌稀釋后形成1/10稀釋液，其次，將制作好的稀釋液放置于36攝氏度左右的環境中，培養18至24小時，培養完成后將稀釋液用平板畫線法在血平板上畫線處理，再次在36攝氏度的環境中培養18至24小時。最后，經過培養的平板上會出現一些顏色為灰黑色，呈圓形，并且周圍有些許雜質和一層透明帶的物質，將這些物質采集下來經過顯微鏡檢查和凝固酶實驗就可以得到食品的金黃色葡萄球菌檢測。在金黃色葡萄球菌的生物分子檢測方法中，PCR檢測法是最主要的一種方法，PCR檢測法則既能檢測到活的金黃色葡萄球菌，又能檢測到死的金黃色葡萄球菌。因此，PCR檢測法與其他檢測方法相比較而言所得到的結果更加精準，并且能在短時間內得到檢測結果[3]。

2.4 檢測乳酸菌

與常規qPCR技術相類似，目前PMA-qPCR技術檢測單一乳酸菌的活菌數量已經在很多乳酸菌菌株中研究成功，如副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌BB12等。我國張和平團隊也報道了PMA-qPCR技術檢測植物乳桿菌P-8的研究。Desfossés-Foucault等在定量檢測鼠李糖乳桿菌時，還設計了一條探針引物以進一步確保對目標菌株計數的靈敏性和準確性。但是，由于在乳酸菌食品中，一般是多種乳酸菌混合添加的，因此，同時檢測不同種乳酸菌的活菌數將更符合乳酸菌檢驗的實際需要。Zorica等報道了利用設計的兼并引物，同時對Lb．plaNtarum 564和 Lb．paracasei Z-8 進行檢測。

3 結語

隨著食品微生物檢測技術的快速發展，如何提高檢測的效率和精確度已經成為食品微生物檢測發展的重要因素，目前PCR技術在實踐和應用的過程中還存在某些缺陷，但是隨著PCR技術的快速發展與完善，食品微生物檢測的整體水平也會不斷提升。總而言之，微生物的快速檢測在食品衛生微生物檢測方面的作用越來越重要，PCR技術能夠融合免疫學分子生物學計算機技術，快速建立食品微生物檢測模型，確保食品微生物檢測標準更高、效率更高、敏靈敏度更高，為我國的食品安全做出重要的貢獻。