綠肥壓青量對烤煙根際土壤可培養微生物的影響

龍成江, 葛永琴, 喻 延, 鄒敏杰, 楊 露, 彭麗娟

(1.貴州省煙草公司黔南州公司，貴州 都勻 558000;2.貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學煙草學院，貴州 貴陽 550025)

綠肥是農業生產中重要的有機生物肥源，綠肥壓青還田能夠改善土壤理化性質、提高作物產量、增加土壤肥力[1]。土壤微生物是土壤生態系統中最活躍的部分[2]，在土壤有機物的分解與合成、腐殖質的形成及養分循環等生態過程中具有不可忽視的作用[3-5]，土壤結構、顆粒大小、有機質含量都會影響土壤微生物的群落結構[6]。胡亞林等[7]研究表明，施用不同類型肥料能改變土壤理化性質，影響地上植物的生長發育，從而間接影響土壤微生物群落。已有研究表明，綠肥、廄肥等有機肥既能夠補充土壤有機碳源，又能夠改善土壤的理化性狀，有利于提高土壤微生物的活性及其多樣性[8-10]；部分土壤根際微生物可在植物根部周圍形成保護屏障，防治植物病害。因此，土壤微生物常被作為評價土壤生態環境質量的重要指標[11]。

烤煙是貴州七大經濟作物之一。貴州是我國第二大烤煙種植區，但當地土壤耕作與施肥方式單一，單作且連作面積較大。李遠遠[12]研究表明，隨著連作年限的增加，煙田土壤微生物多樣性下降。合理的耕作管理方式是提高烤煙生產力的重要措施，為此，本試驗在貴州省福泉市采用綠肥壓青的還田方式，研究不同壓青量對烤煙根際可培養微生物的影響，以了解綠肥壓青還田對改良土壤生態的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2018年4―9月在貴州省福泉市藜山鄉猴昌坪(107°36′24″E，26°43′8″N)進行，烤煙品種為云煙87，壓青材料為光葉紫花苕(Viciavillosarothvar)。試驗地為黃壤，地勢平坦、灌溉方便，距離公路500 m以上，連續覆蓋地膜多年、肥力中等且相對均勻，在上一種煙季煙草花葉病、青枯病、黑脛病和根結線蟲病等病害發生較輕。試驗地海拔937 m，為亞熱帶季風濕潤氣候。

1.2 試驗設計

光葉紫花苕進入盛花期時收割鮮草并切成10～20 cm的節段鋪于地上，于烤煙春耕備栽時整地起壟并翻壓入土。翻犁，翻壓深度20 cm。本試驗壓青量設4個處理。處理1為光葉紫花苕收割后直接起壟(壓青量為0 kg·hm-2，CK)；處理2～處理4壓青量分別為15.0、22.5、30.0 t·hm-2。完全隨機區組設計，3次重復，12個小區，行距為1.1 m、株距為0.6 m，小區面積為40 m2。

1.3 土壤可培養微生物的分離與初步鑒定

1.3.1 分離 分別于移栽后30、60、90和120 d對各處理煙壟進行根際土壤取樣。采用5點取樣法，采集1 kg新鮮根際土壤，裝于打孔透氣的自封袋內。取樣當天立即送貴州大學植物病理學實驗室，采用稀釋平板法[13]進行土壤可培養微生物分離。其中，分離真菌的懸浮液稀釋倍數分別為102、103，采用PDA培養基分離培養；放線菌的懸浮液稀釋倍數分別為103、104，采用“高氏一號”培養基分離培養；細菌的懸浮液稀釋倍數分別為104、105，采用NA培養基分離培養。純化后的真菌、細菌和放線菌先根據形態特征加以初步判斷，將其中菌落特征一致的菌株歸為一類保存后再用于種類鑒定。

1.3.2 初步鑒定 參考宋曉蘭[14]的方法，基于分離物的形態特征和序列同源性比對，對烤煙移栽后30、60、90和120 d的煙壟根際土壤真菌、細菌和放線菌的屬或可能種進行初步鑒定。(1)真菌。用無菌接種針挑取培養好的真菌，于顯微鏡下觀察產孢結構及孢子形態特征，并參考文獻[15]進行屬或種的鑒定。進行序列同源性比對時，采用BIOMIGA公司的小量提取試劑盒提取真菌gDNA，PCR擴增引物為ITS1/ITS4[16]。(2)細菌。先進行革蘭氏染色并觀察菌體形態，芽孢桿菌屬則進行芽孢染色[13]。進行序列同源性比對時，采用BIOMIGA公司的小量提取試劑盒提取細菌gDNA，擴增引物為16S rDNA通用引物27F/1492R。(3)放線菌。參考阮繼生等[17]方法初步鑒定到屬。進行序列同源性比對時，采用BIOMIGA公司的小量提取試劑盒提取放線菌gDNA，擴增引物為16S rDNA通用引物27F/1492R。

在進行序列同源性比對時，三類微生物的PCR產物經電泳檢測，若條帶清晰明亮且無雜帶，則視為合格。將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果與NCBI數據庫已知序列比較同源性。

1.3.3 計數 (1)采用描點法計算烤煙根際可培養細菌、放線菌和真菌數量[1]。計算公式[18]為：

每克土壤樣品菌落數=幾次重復平板的總菌落平均數×稀釋倍數×10

(2)參照趙麗琨[19]的方法，將微生物菌屬劃分為優勢屬、常見屬以及稀有屬等3類。分離頻率≥10%為優勢屬；分離頻率在1%～10%之間為常見屬；分離頻率<1%為稀有屬。

分離頻率/%=(分離某一微生物菌落數/分離該類微生物菌落總數)×100

1.4 數據處理

使用Excel 2010對試驗數據進行統計，并通過SPASS對數據作LSD分析。

2 結果與分析

2.1 壓青量對烤煙根際可培養真菌的影響

2.1.1 數量 移栽30～120 d的烤煙根際土壤中真菌數量變化趨勢如圖1所示。由圖1可知，移栽30、60、90 d時處理2、處理3和處理4的可培養真菌數比CK高，表明綠肥壓青可適當增加土壤中可培養真菌數量。其中，處理2最高。移栽30～90 d，CK可培養真菌數量持續減少，但在90～120 d期間有所增加，具體原因尚待研究。移栽30 d時處理2可培養真菌數量最高，移栽120 d時處理2數量最少。從烤煙根際土壤可培養真菌數量變化來看，處理2較好。

2.1.2 多樣性 移栽30 d時，不同壓青量處理的烤煙根際真菌種群多樣性見表1。4個處理共分離到可培養真菌427株，初步鑒定為6屬32個可能種。4個處理均分離到曲霉屬(Aspergillus)真菌，且種類最多，為優勢屬。其次是球托霉屬(Gongronella)和木霉屬(Trichoderma)。

2.2 壓青量對烤煙根際可培養細菌的影響

2.2.1 數量 不同壓青量處理下烤煙移栽30～120 d的根際土壤可培養細菌數量變化見圖2。由圖2可知，移栽30 d時，處理3可培養細菌數量最高，其次是處理2、處理4，CK最低。隨著移栽時間的延長，處理2、處理3和處理4均呈持續下降趨勢，其中處理3下降最為明顯。從圖2還可見，移栽30 d時各處理間可培養細菌數量差距較大，處理3可培養細菌數量為2.5×106cfu·g-1，而CK僅0.5×106cfu·g-1，隨著移栽時間的延長，各處理間差距逐漸縮小，120 d時各處理基本處于同一水平。

圖2 壓青處理下烤煙根際土壤可培養細菌隨移栽時間的變化

2.2.2 多樣性 移栽30 d時，不同壓青量處理的烤煙根際細菌種群多樣性見表2。從表2可見， 4個處理共分離細菌404株，初步鑒定為6屬27個可能種。4個處理均分離到芽孢桿菌屬(Bacillus)，為優勢屬。

表2 壓青量對烤煙根際細菌種群多樣性的影響

2.3 壓青量對烤煙根際可培養放線菌的影響

2.3.1 數量 不同壓青量處理下烤煙移栽30～120 d的根際土壤可培養放線菌數量變化見圖3。由圖3可知，處理2烤煙根際可培養放線菌數量最多。隨著移栽時間的延長，處理2、處理3和處理4可培養放線菌數量均快速下降，但CK在60 d后逐漸上升，到120 d時甚至超過其他3個處理。

圖3 壓青處理下烤煙根際土壤可培養放線菌隨移栽時間的變化

2.3.2 多樣性 移栽30 d時，不同處理烤煙根際土壤可培養放線菌種群多樣性見表3。4個處理共分離到放線菌141株，初步鑒定為3屬25個可能種。從表3還可看出，放線菌優勢屬為鏈霉菌屬(Streptomyces)。

表3 壓青量對烤煙根際放線菌種群多樣性的影響

3 討論與結論

3.1 壓青量對烤煙根際土壤可培養微生物數量的影響

土壤微生物在土壤元素循環、有機質分解以及腐殖質形成等生物化學過程中具有不可忽視的作用[20]。綠肥既能夠補充土壤有機碳源，還能夠改善土壤的理化性狀，從而有利于提高土壤微生物活性及其多樣性[10]。本研究表明，采用綠肥壓青還田后，對真菌生物量影響最大，其次是細菌和放線菌。從不同處理間的差異來看，綠肥壓青比無壓青煙田更有利于根際微生物的生長繁殖。細菌和放線菌種類、數量變多有利于土壤養分的轉化，通過營養抗性來抵御有害生物如土傳病害的生長和繁殖[21]。羅貞寶[22]研究表明，土壤真菌數量的增加，一方面能促進有機殘體分解，形成一定量的腐殖質；另一方面則可能加劇作物遭受土傳植物病原真菌為害的風險。因此，施用適量的綠肥對改善和修復土壤微生態環境具有重要的作用。

楊新才[23]研究表明，種植光葉紫花苕能增加土壤生物固氮、生物覆蓋和生物富集，促進土壤有機質的積累與更新。本研究表明，經光葉紫花苕壓青處理的煙田，可顯著提高烤煙根際微生物的數量。烤煙移栽30 d時，處理2、處理3和處理4分離到的可培養真菌、細菌和放線菌數量最多，隨后均呈下降趨勢，表明壓青效果逐漸降低；處理1(無壓青)的可培養真菌、細菌和放線菌則呈緩慢上升趨勢，移栽120 d后，均高于其他3個處理。可能原因如下：一是初期綠肥自帶的微生物；二是隨時間推移光葉紫花苕中有機氮被分解成無機氮，提高土壤中無機物含量，對微生物繁殖產生抑制作用[2]。

3.2 壓青量對烤煙根際土壤可培養微生物分離頻率的影響

本研究表明，不同壓青量對烤煙根際土壤可培養微生物分離頻率有影響。就可培養真菌而言，壓青光葉紫花苕15.0 t·hm-2(處理2)所分離種類最多，可達10種，其中曲霉屬的分離頻率最高，為優勢種。就可培養細菌而言，壓青光葉紫花苕15.0 t·hm-2(處理2)與22.5 t·hm-2(處理3)所分離種類最多，達8種，其中芽孢桿菌屬的分離頻率最高，為優勢種。就可培養放線菌而言，壓青光葉紫花苕15.0 t·hm-2(處理2)所分離種類最多，達8種，其中鏈霉菌屬的分離頻率最高，為優勢種。

綜合可培養微生物屬的種類及數量，與無壓青煙田比較，光葉紫花苕壓青能促進烤煙根際微生物的生長，以每公頃(hm2)壓青光葉紫花苕15.0 t的煙田較為適宜。