杜仲葉的營養(yǎng)評(píng)價(jià)及體外抗氧化活性分析

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(1.廣東省測試分析研究所,廣東省分析測試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510070;2.吉首大學(xué),杜仲綜合利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南張家界 427000)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)又名思仲、思仙等,為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木。傳統(tǒng)以樹皮入藥,具有補(bǔ)肝益腎、強(qiáng)筋健骨、安胎等功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明,杜仲葉與皮具有極其類似的化學(xué)成分及藥理活性。杜仲葉作為單科、單屬、單種植物,在不同地域,其內(nèi)在化學(xué)成分的種類基本相同,但是由于受不同地區(qū)的土壤、溫度、濕度、降雨量、經(jīng)緯度以及海拔等環(huán)境條件的影響,使部分化學(xué)成分在杜仲葉內(nèi)的含量存在差異[2]。湖南省張家界市慈利縣素有“中國杜仲之鄉(xiāng)”的美稱,其所種植的杜仲不僅品種好,而且葉中有效成分含量高,深受消費(fèi)者青睞。杜仲葉含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)成分,以及木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類和多糖類等藥用成分,其作為木脂素類化合物的丁香脂素二葡萄糖苷具有抗疲勞、抗癌、增強(qiáng)記憶力和較強(qiáng)的抑制cMAP磷酸二酯酶的作用[3];作為環(huán)烯醚萜類化合物桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸具有明顯抗骨質(zhì)疏松的生物活性[4-5];作為苯丙素類化合物,綠原酸具有抗高血壓和降血脂的生物活性[6-8];作為黃酮類化合物,蘆丁具有較強(qiáng)的降壓和舒張血管的作用[9-10]。2018年4月,國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布“關(guān)于征求將黨參等9種物質(zhì)作為按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)(簡稱食藥物質(zhì))管理意見的函(國衛(wèi)辦食品函[2018]278號(hào)),擬將杜仲葉列入食藥物質(zhì)目錄,為杜仲葉作為新型食品資源開發(fā)開辟了綠色通道。

有關(guān)杜仲葉的相關(guān)報(bào)道主要集中在對其功效成分的藥理活性方面的研究,如Keiichi等[11]研究發(fā)現(xiàn),含綠原酸、京尼平苷酸和車葉草苷的杜仲葉提取物可顯著抑制由UVB誘導(dǎo)的接觸性過敏反應(yīng);Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn),70%乙醇提取物可抑制滑膜細(xì)胞的增殖,減少軟骨和骨骼的退化,從而起到緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用;Lee等[13]研究表明,杜仲葉水提物可降低體內(nèi)NO水平,調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能障礙。杜仲葉作為我國傳統(tǒng)飲食習(xí)慣上食用的中藥材,其食用歷史悠久,早在明代的《本草綱目》及清代的《廣群芳譜》就有相關(guān)記載[14]。近年來,以杜仲葉為原料的產(chǎn)品層出不窮,如張松等[15]以杜仲葉為原料,研制出深受消費(fèi)者青睞的菜點(diǎn)食品;羅威等[16]和張志健等[17]以杜仲葉為主要原料分別研制出具有獨(dú)特風(fēng)味的復(fù)合飲品。劉亮等[18]以牛乳和杜仲茶粉為原料研制出了色、香、味俱全的保健酸奶。目前,大多數(shù)學(xué)者主要側(cè)重于杜仲葉在食品方面的開發(fā)利用,而關(guān)于杜仲葉營養(yǎng)成分及評(píng)價(jià)的研究卻少有詳細(xì)報(bào)道,嚴(yán)重限制了其作為新型食品資源的開發(fā)與利用。

鑒于此,本試驗(yàn)以慈利縣杜仲葉為原料,對其營養(yǎng)成分及功效成分含量進(jìn)行測定,并采用營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)對杜仲干葉中氨基酸、微量元素等營養(yǎng)成分進(jìn)行全面、系統(tǒng)的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)估,以期為杜仲葉作為新型食品資源在功能性食品產(chǎn)品開發(fā)和深加工方面提供理論依據(jù),同時(shí)為杜仲葉的產(chǎn)業(yè)化及開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 于2017年8月采摘于湖南省慈利縣江埡林場(北緯29°15′51.84″ 東經(jīng)11°36′36″),經(jīng)吉首大學(xué)谷伏安副教授鑒定為杜仲科杜仲屬杜仲葉,樣品采集后50 ℃烘干,粉碎后過篩(<0.3 mm),置于干燥器內(nèi)備用;硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、鹽酸、硼酸、乙醇、無水乙醚、石油醚、正庚烷、氯化鈉、無水硫酸鈉、苯酚、檸檬酸鈉、磷酸等試劑 分析純,廣州化學(xué)試劑廠;硝酸 優(yōu)級(jí)純,廣州化學(xué)試劑廠;甲醇 色譜純,Honeywell公司;甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑 分析純,天津博迪化工股份有限公司;14%三氟化硼甲醇溶液 CNW公司;2,2-聯(lián)氮-二-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、過硫酸鉀 阿拉丁試劑有限公司;羥基自由基試劑盒 南京建成生物工程研究所;抗壞血酸(VC)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、福林酚、無水碳酸鈉、氫氧化鈉 麥克林試劑有限公司;維生素E、B1、B2、C標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院;16種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) NU-CHEK PREP公司;L-天門冬氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-蛋氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-半胱氨酸共17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) WAKO公司生產(chǎn);色氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) Dr.Ehrenstorfer公司;鈉、鎂、鉀、鈣、鐵、銅、鋅、錳、鍶、硼、硒、鎳、鉻、釩、鈷、砷、鎘、錫、鋇、鉛、鈦元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院;葡萄糖、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院;實(shí)驗(yàn)用水 符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

DHG-9140A型恒溫干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;N 310自動(dòng)凱氏定氮儀 廣州格丹納儀器有限公司;GC-2010 plus氣相色譜儀、UV-2700型紫外可見分光光度計(jì)、LC-20A型液相色譜儀 日本島津公司;HP-88型毛細(xì)管色譜柱(100 m×0.25 mm,0.25 μm)、7800型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國安捷倫公司;L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀、ZA3000型原子吸收分光光度計(jì) 日本日立公司;BDS HYPERSIL C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 德國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 常規(guī)理化指標(biāo)測定方法

1.2.1.1 基本營養(yǎng)成分測定 水分測定方法按照GB 5009.3-2016[19];灰分按照GB 5009.4-2016測定[20];蛋白質(zhì)按照GB 5009.5-2016測定[21];脂肪按照GB 5009.6-2016測定[22]。總膳食纖維、不溶性膳食纖維、可溶性膳食纖維按照GB 5009.88-2014測定[23]。能量、碳水化合物按照GB 28050-2011進(jìn)行計(jì)算[24]。維生素E按照GB 5009.82-2016測定[25],維生素B1按照GB 5009.84-2016測定[26],維生素B2按照GB 5009.85-2016測定[27],維生素C按照GB 5009.86-2016測定[28]。

1.2.1.2 脂肪酸組成測定 脂肪酸組成按照GB 5009.168-2016進(jìn)行測定[29],樣品采用酸水解法進(jìn)行水解,經(jīng)石油醚-乙醚提取脂肪后,蒸干溶劑,加入2%氫氧化鈉甲醇溶液進(jìn)行脂肪的皂化,再加入14%三氟化硼甲醇溶液進(jìn)行脂肪酸的甲酯化。

1.2.1.3 氨基酸含量測定 色氨酸按照GB/T 15400-1994測定[30],其余水解氨基酸按照GB 5009.124-2016測定[31],游離氨基酸按照GB/T 30987-2014測定[32]。

1.2.1.4 氨基酸營養(yǎng)價(jià)值與風(fēng)味評(píng)價(jià)方法 食物中必需氨基酸(EAA)模式越接近人體蛋白質(zhì)組成越易被消化利用。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織(Food and Agriculture Organization/World Health Organization,FAO/WHO)1973年建議的氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式,按下列公式計(jì)算氨基酸評(píng)分(Amino acids score,AAS)和氨基酸比值系數(shù)(Ratio coefficient of amino acid,RC),并根據(jù)AAS、必需氨基酸與總氨基酸比值(EAA/TAA)、必需氨基酸與非必需氨基酸比值(EAA/NEAA)等要素來綜合評(píng)價(jià)杜仲葉的氨基酸營養(yǎng)價(jià)值;氨基酸風(fēng)味成分按照氨基酸含量用味覺閾值比來分析,評(píng)價(jià)指標(biāo)為含量閾值比(Ratio of content and taste threshold,RCT)。

AAS(%)=待測樣品氨基酸含量(mg/g粗蛋白)/(FAO/WHO建議模式中同種氨基酸含量(mg/g粗蛋白))×100

式(1)

氨基酸比值系數(shù)RC=AAS/AAS的平均值

式(2)

RTC=某風(fēng)味氨基酸含量(g/kg)/相應(yīng)氨基酸的味覺閾值(g/kg)

式(3)

1.2.1.5 礦物質(zhì)元素分析 鈉元素按照GB 5009.91-2017測定[33],其余礦物質(zhì)元素按照GB 5009.268-2016進(jìn)行測定[34],樣品按照微波消解法進(jìn)行處理。

1.2.1.6 礦物質(zhì)元素營養(yǎng)評(píng)價(jià) 采用食物營養(yǎng)質(zhì)量指數(shù)法(Index of nutrition quality,INQ)對杜仲葉中所含礦物質(zhì)進(jìn)行營養(yǎng)評(píng)價(jià)。

INQ=100 g食物中某營養(yǎng)素密度/100 g食物熱量密度

式(4)

式中:營養(yǎng)素密度=100 g食物中某營養(yǎng)素含量/指定人體每日所需該營養(yǎng)素量;熱量密度=100 g食物的熱量/指定人體每日所需熱量。

當(dāng)INQ>1時(shí),食物提供營養(yǎng)素的能力大于提供熱量的能力,即熱量滿足需求時(shí),營養(yǎng)素有盈余;當(dāng)INQ=1時(shí),食物提供營養(yǎng)素的能力等于提供熱量的能力,二者滿足人體需求的能力相當(dāng);當(dāng)INQ<1時(shí),食物提供營養(yǎng)素的能力小于提供熱量的能力,必須攝入過量的熱量才能滿足營養(yǎng)素的需求。熱量的過多攝入不利于人體健康,因而INQ≥1的食物為優(yōu)質(zhì)食物,INQ<1的食物為劣質(zhì)食物[35]。

1.2.1.7 粗多糖含量測定 粗多糖的測定按照《保健食品功效成分檢測方法》(2016版)中的苯酚硫酸比色法[36]。準(zhǔn)確稱取杜仲葉樣品1.0 g,置于100 mL容量瓶中,加水約80 mL,于沸水浴中加熱1 h,冷卻至室溫后補(bǔ)加水至刻度,混勻后過濾,收集濾液。準(zhǔn)確吸取濾液5 mL,置于50 mL離心管中,加入無水乙醇20 mL,充分混勻,于4 ℃冰箱靜置4 h后,以4000 r/min離心10 min,反復(fù)離心3次后棄去上清液,殘?jiān)盟芙舛ㄈ葜?5 mL后,取適量溶液顯色。以葡萄糖質(zhì)量(x,mg)為橫坐標(biāo),以吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=0.00528x-0.00575,相關(guān)系數(shù)R2=0.9990。

1.2.1.8 總多酚、總黃酮含量測定 總多酚含量測定按照GB/T 8313-2008[37]:稱取0.2 g左右的杜仲葉樣品置于10 mL離心管中,加入70 ℃預(yù)熱的70%的甲醇溶液10 mL,攪拌均勻,立即移入70 ℃水浴中,浸提10 min(每隔5 min攪拌一次),浸提后冷卻至室溫,將浸提液以4000 r/min離心10 min后轉(zhuǎn)移至容量瓶,殘?jiān)儆?0 mL70%的甲醇溶液重復(fù)提取一次,合并上清液,定容后以沒食子酸為當(dāng)量測定杜仲葉中總多酚含量。以沒食子酸質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo),以吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=0.01004x+0.01846,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

總黃酮含量按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)中“二十四、保健食品中總黃酮的測定”進(jìn)行測定[36]:稱取0.5 g左右杜仲葉樣品,用濾紙包緊,置于平底燒瓶中加入50 mL70%乙醇溶液,浸潤后,在80 ℃水浴回流2 h,至黃酮類化合物基本提取完全。待粗提液冷卻后,減壓抽濾,并用少量70%乙醇溶液洗滌殘?jiān)?合并濾液后,在50 ℃下減壓蒸餾,除去其中的乙醇,帶溶液冷卻后,收集并定容至50 mL。吸取適量的杜仲葉提取液于蒸發(fā)皿中,加1 g聚酰胺吸附,然后用甲醇洗脫,收集洗脫液,定容于25 mL容量瓶。采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量。以蘆丁質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo),以吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=0.02850x+0.01470,相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。

1.2.1.9 主要功效成分含量測定 桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和蘆丁六種最具代表性的活性成分測定參考周云雷等[38]的方法進(jìn)行測定,并稍作修改。準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品,按料液比1∶20 (g∶mL)用50%乙醇水溶液超聲(超聲功率為400 W)提取30 min,重復(fù)提取兩次后,過濾,合并濾液。濾液取1 mL用甲醇稀釋至10 mL,過0.45 μm濾膜,進(jìn)液相色譜儀測定。以桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和蘆丁的質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo),以峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程分別為:桃葉珊瑚苷:y=5011x-16082,R2=0.9991;京尼平苷酸:y=16719x+1494,R2=0.9999;綠原酸:y=41140x+811.2,R2=0.9999;松脂醇二葡萄糖苷:y=18941x+5794,R2=0.9999;京尼平苷:y=19584x+882.8,R2=0.9999;蘆丁:y=21150x+8303,R2=0.9999。

液相色譜條件:色譜柱為Thermo BDS HYPERSIL C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相A為甲醇,B為0.1%磷酸水溶液。梯度洗脫:0～6 min,6% A;6～13 min,6%～13% A;13～14.50 min,13%～18% A;14.50～22 min,18%～20% A;22～30 min,20%～40% A;30～45 min,40%～45% A;45%～46 min,45%～50% A;46～60 min 50%～55%。流速:0.8 mL/min,柱溫:35 ℃,進(jìn)樣量:10 μL,程序化變波長:202 nm(0～14.5 min,桃葉珊瑚苷)、238 nm(14.5～23 min,京尼平苷酸)、326 nm(23～29 min,綠原酸)、240 nm(29～37 min,京尼平苷)、226 nm(37～40 min,松脂醇二葡萄糖苷)、254 nm(40～60 min,蘆丁)。

1.2.2 杜仲葉提取物抗氧化活性測定 將一定量的杜仲葉粉按1.2.1.9提取方法制備杜仲葉提取物,于-20 ℃保存,用于體外抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1 對DPPH自由基清除效果 參考王翔等[39]報(bào)道的方法進(jìn)行測定,并稍作修改。稱取一定量的DPPH,用無水乙醇溶解并配制成0.20 mmol/L溶液。分別取不同質(zhì)量濃度(20、40、60、80和100 mg/L)的樣品2 mL與2 mL DPPH溶液混用,于黑暗中25 ℃水浴中保溫30 min,以無水乙醇為對照;其他條件不變,用2 mL無水乙醇替代DPPH溶液,以此為空白組;同時(shí)以VC(5、10、15、20和25 mg/L)和BHT(20、40、60、80和100 mg/L)作為抗氧化活性測定的陽性對照組,在紫外可見分光光度計(jì)上517 nm測定吸光值,計(jì)算杜仲葉提取物對DPPH·的清除率(ηDPPH·),計(jì)算公式見式(5):

式(5)

式中:A0-對照管吸光度值;A1-樣品吸光度值;A2-空白管吸光度值。

1.2.2.2 對ABTS+自由基清除效果 參考王翔等[39]報(bào)道的方法進(jìn)行測定,并稍作修改。配制不同質(zhì)量濃度杜仲葉提取物(10、20、30、40和50 mg/L)及陽性對照品VC(2、4、6、8和10 mg/L)和BHT(10、20、30、40和50 mg/L)溶液。分別取0.4 mL配制好的杜仲葉提取物、VC和BHT樣品溶液于10 mL試管中,加入3.6 mL ABTS+·溶液后搖晃混勻,室溫下反應(yīng)6 min后,在734 nm波長下檢測每支試管中樣品溶液的吸光度值,計(jì)算杜仲葉提取物對ABTS+自由基的清除率(ηABTS+·);其他條件不變,以無水乙醇為對照,用3.6 mL無水乙醇替代ABTS+·溶液,以此為空白組。清除率計(jì)算公式見式(6)：

式(6)

式中:A0-對照管吸光度值;A1-樣品吸光度值;A2-空白管吸光度值。

1.2.2.3 對·OH自由基清除效果 試驗(yàn)使用羥基自由基試劑盒測定杜仲葉提取物對·OH的清除效果。體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH,當(dāng)給予電子受體后,用Griess試劑顯色,可形成紅色物質(zhì),其呈色與·OH量成正比。試驗(yàn)條件和操作方法按照用戶手冊進(jìn)行并稍作修改,測試樣品配成不同濃度的溶液,以VC和BHT作為陽性對照組。·OH清除率(η·OH)計(jì)算見式(7):

式(7)

式中:A0-對照管吸光度值;A1-樣品吸光度值;A2-空白管吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 基本營養(yǎng)成分分析

基本營養(yǎng)成分分析結(jié)果見表1,蛋白質(zhì)是構(gòu)成一切生命的主要化合物,是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)和第一要素,如若缺少蛋白質(zhì),可導(dǎo)致人體免疫功能下降。杜仲葉中蛋白質(zhì)含量(11.50 g/100 g),要高于大多數(shù)禾谷類食品[41],因此可作為一定的膳食蛋白質(zhì)來源,補(bǔ)充人體所需的蛋白質(zhì)。此外,杜仲葉中脂肪含量為5.550 g/100 g,碳水化合物含量為27.00 g/100 g,每100 g杜仲葉可提供1167 kJ能量,可作為供能物質(zhì)為人體提供一定的能量。杜仲葉中膳食纖維含量豐富,總膳食纖維含量為38.40 g/100 g,其中不溶性膳食纖維含量為35.50 g/100 g,可溶性膳食纖維含量為2.890 g/100 g。不溶性膳食纖維具有增加糞便體積、刺激腸道蠕動(dòng)、降低患腸癌的概率的作用,可溶性膳食纖維具有調(diào)節(jié)血糖、降低膽固醇的作用[40]。

維生素是維持身體健康所必須的一類有機(jī)化合物。杜仲葉中維生素C含量較為豐富13.40 mg/100 g,其含量高于芹菜中維生素C含量(10.50 mg/100 g)[42],維生素C廣泛存在于植物組織中,是鑒定水果蔬菜產(chǎn)品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。同時(shí),維生素C也是人體需求量最大的一種維生素,具有顯著的抗氧化和降血膽固醇、減緩動(dòng)脈粥樣硬化等作用,此外,維生素C能預(yù)防和治療壞血病,促進(jìn)鐵的吸收、細(xì)胞間質(zhì)的生長,對輔助治療缺鐵性貧血有一定的作用,在營養(yǎng)與疾病防治中發(fā)揮著重要作用;維生素B2是水溶性維生素,容易消化和吸收,能促進(jìn)發(fā)育和細(xì)胞的再生,促使皮膚、指甲、毛發(fā)的正常生長,其被排出的量隨體內(nèi)的需要以及可能隨蛋白質(zhì)的流失程度而有所增減;它不會(huì)蓄積在體內(nèi),所以時(shí)常要以食物或營養(yǎng)補(bǔ)品來補(bǔ)充。杜仲葉中維生素B2的含量為3.350 mg/100 g,高于黑枸杞中維生素B2含量(1.930 mg/100 g)[43],其可作為一定的天然維生素B2補(bǔ)充劑來部分替代營養(yǎng)補(bǔ)品;維生素E和維生素B1的含量分別為1.230和0.070 mg/100 g,研究表明,維生素B1具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用,此外,還能促進(jìn)腸胃蠕動(dòng),增加食欲;維生素E能促進(jìn)生殖,具有抗自由基氧化、抑制血小板聚集等多種作用。

表1 杜仲干葉的基本營養(yǎng)成分檢測結(jié)果Table 1 Basic nutritional components analysis results of

2.2 脂肪酸組成分析

表2 杜仲葉脂肪酸成分分析結(jié)果Table 2 The results of fatty acid conposition analysis

脂肪酸組成分析結(jié)果見表2,從杜仲葉的脂肪中主要檢測出7種脂肪酸,分別是棕櫚酸(C16∶0)19.3%,硬脂酸(C18∶0)2.77%,油酸(C18∶1n9)3.89%,亞油酸(C18∶2n6)2.66%,花生酸(C20∶0)1.08%,α-亞麻酸(C18∶3n3)55.5%,二十一烷酸(C21∶0)5.44%。杜仲葉脂肪中不飽和脂肪酸比例高達(dá)62.5%,其中α-亞麻酸是杜仲葉脂肪中最主要的脂肪酸成分,含量為55.5%。α-亞麻酸是一種重要的不飽和脂肪酸,屬于ω-3系列脂肪酸,可轉(zhuǎn)化為二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA),同時(shí)對人體有降血脂、降膽固醇作用,有助于防治動(dòng)脈粥樣硬化和減少心腦缺血性疾病的發(fā)生[44]。因此杜仲葉可以作為獲取α-亞麻酸的重要來源,優(yōu)化所加工食品的脂肪酸組成。

2.3 氨基酸含量分析與評(píng)價(jià)

杜仲葉中的水解氨基酸和游離氨基酸檢測結(jié)果見表3,從結(jié)果可以看出杜仲葉中含有齊全的水解氨基酸,總含量為9.07 g/100 g,其中必需氨基酸含量為3.88 g/100 g,必需氨基酸與總氨基酸含量百分比(EAA/TAA)為42.80%,必需氨基酸與非必需氨基酸含量百分比(EAA/NEAA)為74.90%。根據(jù)FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)模式[45],其氨基酸組成EAA/TAA在40%左右,EAA/NEAA在60%以上為高質(zhì)量蛋白,因此杜仲葉中的蛋白質(zhì)屬于優(yōu)質(zhì)的植物蛋白。由表4杜仲葉氨基酸評(píng)分(AAS)結(jié)果可以看出,色氨酸的含量遠(yuǎn)高于FAO/WHO建議值,AAS達(dá)到461.0%,除含硫氨基酸(蛋氨酸+半胱氨酸)和賴氨酸外,其余大部分氨基酸的AAS接近或超過100%,說明杜仲葉蛋白質(zhì)中的大部分必需氨基酸的比例符合人體需求。蛋氨酸+半胱氨酸的AAS最低,僅25.80%,其次是賴氨酸,AAS為69.10%,說明蛋氨酸為杜仲葉的第一限制氨基酸,而賴氨酸為第二限制氨基酸。此外,通過計(jì)算氨基酸比值系數(shù)(ratio of coefficient of amino acid,RC),也得到相應(yīng)結(jié)果。當(dāng)RC=1時(shí),說明食品中此種氨基酸的含量與氨基酸模式譜要求一致;RC>1時(shí),說明此種氨基酸相對過剩;而RC<1時(shí),說明此種氨基酸不足。通過計(jì)算表明,Trp含量過剩;Ile、Leu、Lys、Phe+Tyr、Thr、Val的含量略顯不足;而杜仲葉中Met+Cys含量偏低,為第一限制。因此,在杜仲葉食品開發(fā)過程中,應(yīng)注意與含蛋氨酸和賴氨酸的食材合理搭配,保證人體所需的必需氨基酸均衡。

氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)不同,其結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生差異,而這一差別也影響了氨基酸的口味感官。D-型氨基酸大多以甜味為主;在L-型氨基酸中,當(dāng)側(cè)基很小時(shí),一般以甜感占優(yōu)勢,當(dāng)側(cè)基較大并帶堿基時(shí),通常以苦味為主;若側(cè)基帶有芳香基團(tuán)時(shí),通常具有香味。按照氨基酸的味覺強(qiáng)度,可以大致把氨基酸分為甜味氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、His)、苦味氨基酸(Val、Leu、Ile、Met、Trp、Arg)、鮮味氨基酸(Lys、Glu、Asp)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Cys)[46]。然而,不同氨基酸的味覺閾值不同,含量高的風(fēng)味氨基酸并非一定對食品的風(fēng)味貢獻(xiàn)大,因此用杜仲葉中各種風(fēng)味氨基酸含量與其味覺閾值即含量閾值比(ratio of content and taste threshold,RCT)評(píng)價(jià)各種氨基酸對蒲桃口感的貢獻(xiàn)(表3)。當(dāng)RCT<1時(shí),表明該種氨基酸對杜仲葉的整體風(fēng)味無貢獻(xiàn);RCT≥1時(shí),則表明該種氨基酸味覺特征影響杜仲葉的風(fēng)味,且比值越大,影響越大。杜仲葉中游離氨基酸主要由天門冬氨酸55.7 mg/100 g、谷氨酸43.3 mg/100 g、丙氨酸5.36 mg/100 g、脯氨酸6.34 mg/100 g組成,其中天門冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸均是呈味氨基酸,但對杜仲葉的風(fēng)味有特征影響主要是天門冬氨酸和谷氨酸。

表3 杜仲葉中水解氨基酸和游離氨基酸含量Table 3 Hydrolyzed amino acids and free amino acids analysis results of Eucommia ulmoides

注:總氨基酸:AA;*:必需氨基酸(EAA);*:鮮味氨基酸(DAA);#非必需氨基酸:NEAA。

表4 杜仲葉氨基酸評(píng)分Table 4 Amino acids scores(AAS)of Eucommia ulmoides

2.4 礦物質(zhì)元素分析與評(píng)價(jià)

從表5的結(jié)果可以看出,杜仲葉含有豐富的鉀和鈣,含量分別為1.38×104、1.21×104mg/kg,還含有豐富的鎂和鐵,含量分別為2.02×103、164 mg/kg,其次含有豐富的錳,含量為144 mg/kg。杜仲葉中對人體不可或缺的元素如鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、錳的含量均高于堅(jiān)果仁中的含量[48]。研究表明,過量的氯化鈉攝入或由于不良飲食引起的鉀/鈉比值過低都會(huì)引起高血壓,而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)杜仲葉的鉀/鈉比例分別為594.70,與水果和蔬菜以及人類健康的膳食標(biāo)準(zhǔn)一致(鉀/鈉比>2)。鈣是骨骼生長、肌肉和神經(jīng)功能的重要元素,而杜仲葉中含有較多的鈣元素,顯著高于原鱒魚(632 mg/kg)[49]中鈣的含量。二價(jià)鎂離子是許多酶活性的輔助因子,杜仲葉中含有大量的鎂,其含量甚至是草莓中的鎂含量的2倍[50]。研究表明,缺硒會(huì)引起青少年大骨節(jié)病的發(fā)生,嚴(yán)重地影響骨發(fā)育和日后勞動(dòng)生活能力,杜仲葉含硒量為0.215 mg/kg,具有人體硒元素的來源的潛能。

表5 杜仲葉礦物質(zhì)元素分析結(jié)果Table 5 Mineral elements analysis results of Eucommia ulmoides

美國Hansen等[51]于1979年提出“營養(yǎng)質(zhì)量指數(shù)(INQ)”概念,并認(rèn)為相對于營養(yǎng)素的絕對含量,用INQ法評(píng)價(jià)某種食物中的營養(yǎng)質(zhì)量優(yōu)劣更直觀。INQ法將熱量與營養(yǎng)素含量結(jié)合起來,通過營養(yǎng)素密度與熱量密度的比值,反映一定量某種食物滿足人體熱量需求的程度和滿足人體營養(yǎng)素需求的程度的關(guān)系,既當(dāng)人體從食物中獲得的熱量足夠時(shí),某種營養(yǎng)素是否足夠。因此,本文采用INQ法對蔬菜中礦物質(zhì)元素進(jìn)行營養(yǎng)評(píng)價(jià)。由表5可知,杜仲葉中除Na以外,常見的微量元素(如K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Se)INQ值均大于1,表明當(dāng)杜仲葉達(dá)到人體熱量需求時(shí),K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Se等微量元素也滿足人體需求,并有所盈余。除此之外杜仲葉中含有多種人體所需的微量元素如硼、鍶、鋇、鈦等,這些微量元素對維持人體的各項(xiàng)生理機(jī)能有重要作用(因鋇、鈦不是人體所必需的微量元素,其INQ值無法計(jì)算,所以表5中INQ值未給出)。綜上所述,杜仲葉營養(yǎng)價(jià)值高且全面,有較高的食用和營養(yǎng)保健作用。

2.5 粗多糖、總多酚、總黃酮含量分析

粗多糖、總多酚、總黃酮含量分析結(jié)果見表6。杜仲葉中含有0.989 g/100 g的粗多糖,粗多糖廣泛存在于真菌及植物中,具有多種保健功效,例如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等功效。多酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗癌、抗衰老等多種藥理活性[52-55],被稱為“第七類營養(yǎng)素”,在食品、化妝品及醫(yī)藥等行業(yè)具有廣闊的市場前景,近年來受到人們的廣泛關(guān)注。杜仲葉中含有8.360 g/100 g的總多酚,其含量高于部分茶葉中的多酚含量[56]。黃酮類化合物是許多中藥材的有效成分,具有多種生物活性,杜仲葉與皮具有著極其類似的化學(xué)成分及藥理活性,葉中黃酮類化合物含量更是高于皮[57],而其含量的高低,更是直接影響著杜仲葉質(zhì)量的優(yōu)劣[58],試驗(yàn)測得杜仲葉中總黃酮含量為1.590 g/100 g。

表6 杜仲葉中粗多糖、總多酚、總黃酮含量分析結(jié)果Table 6 Analysis results of crude polysaccharides,total polyphenols and total flavonoids inEucommia ulmoides weight)

2.6 主要功效成分分析

本文還測定了杜仲葉中六種主要功效成分的含量,即桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和蘆丁,見表7。杜仲葉中桃葉珊瑚苷的含量為0.765 g/100 g,桃葉珊瑚苷具有抗氧化、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)血壓等作用,主要存在于忍冬科、車前科和杜仲科等植物中;杜仲葉中京尼平苷酸和京尼平苷的含量分別為3.020、0.0244 g/100 g,京尼平苷酸和京尼平苷具有降血糖、調(diào)血脂、神經(jīng)營養(yǎng)、保肝利膽等作用,主要存在于茜草科、杜仲科、衛(wèi)矛科等植物中[59];杜仲葉中綠原酸的含量為2.670 g/100 g,綠原酸具有保護(hù)心血管、抗氧化、抗癌等作用[60],主要存在于忍冬科忍冬屬、菊科蒿屬等植物中;杜仲葉中松脂醇二葡萄糖苷的含量為0.024 g/100 g,松脂醇二葡萄糖苷是杜仲葉中主要的降壓成分,具有高效、安全、雙向調(diào)節(jié)血壓的功能[61];杜仲葉中蘆丁的含量為0.067 g/100 g,蘆丁具有抗腫瘤、抗炎、抗心腦血管疾病等作用,廣泛存在于植物體中。

表7 杜仲葉中6種功效成分含量分析結(jié)果Table 7 6 functional components analysis results ofEucommia ulmoides weight)

2.7 杜仲葉提物體外抗氧化活性

2.7.1 對DPPH·的清除效果 由圖1可知,杜仲葉提取物具有一定的清除DPPH·能力,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),對DPPH·的清除能力隨提取物濃度的增大而增加,呈現(xiàn)量效關(guān)系。杜仲葉提取物的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為32.89 mg/L,BHT和VC的IC50分別為58.81、6.882 mg/L,說明杜仲葉提取物對DPPH·的清除效果要強(qiáng)于BHT而弱于VC。杜仲葉中酚類化合物含量豐富,其多酚類化合物的酚羥基保證了它提供質(zhì)子的能力,從而達(dá)到清除DPPH·的效果。Xu等[62]研究表明,杜仲葉提取物對DPPH·有較好的清除效果,且清除效果與酚類含量有關(guān)。

圖1 杜仲葉提取物對DPPH·清除效果Fig.1 Free radical scavenging effect(DPPH·)ofextract from Eucommia ulmoides leaves

2.7.2 對ABTS+·清除效果 由圖2可知,杜仲葉提取物具有一定的清除ABTS+·能力,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),對ABTS+·的清除能力隨提取物濃度的增大而增加,呈現(xiàn)量效關(guān)系。杜仲葉提取物的IC50為28.09 mg/L,而BHT和VC的IC50分別為14.34、6.349 mg/L,表明杜仲葉提取物對ABTS+·的清除能力要略弱于BHT和VC。鄧等[63]研究表明,杜仲葉提取物有較好的清除ABTS+·能力,且清除效果與杜仲葉總黃酮含量呈正相關(guān)。

圖2 杜仲葉提取物對ABTS·清除效果Fig.2 Free radical scavenging effect(ABTS·)ofextract from Eucommia ulmoides leaves

2.7.3 對·OH清除效果 由圖3可知,杜仲葉提取物具有較強(qiáng)的清除·OH能力,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),對·OH的清除能力隨提取物濃度的增大而增加,呈現(xiàn)量效關(guān)系。杜仲葉提取物的IC50為235.3 mg/L,而BHT和VC的IC50分別為287.9、284.2 mg/L,表明杜仲葉提取物對·OH的清除效果要強(qiáng)于BHT和VC,其清除機(jī)理可能是由于多酚類化合物的酚羥基的氫與羥基自由基結(jié)合,從而達(dá)到清除效果。李等[64]研究發(fā)現(xiàn),杜仲葉提取物對·OH有較好的清除效果,且清除效果要強(qiáng)于VC,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 杜仲葉提取物對·OH清除效果Fig.3 Free radical scavenging effect(·OH)ofextract from Eucommia ulmoides leaves

3 結(jié)論

杜仲葉中蛋白質(zhì)含量較高,膳食纖維豐富,維生素C和維生素B2含量較高,不飽和脂肪酸比例高,其中α-亞麻酸含量豐富,占脂肪的55.5%;杜仲葉中氨基酸種類齊全,其比例達(dá)到優(yōu)質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn);杜仲葉中還含有豐富鉀(1.38×104mg/kg)、鈣(1.21×104mg/kg)、鎂(2.02×103mg/kg)、鐵(164 mg/kg)元素和多種對人體有益的微量元素;杜仲葉中的粗多糖、總多酚、總黃酮的含量分別為0.989、8.36、1.59 g/100 g,6種主要功效物質(zhì)即桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷和蘆丁的含量分別為0.765、3.02、2.67、0.0126、0.0244、0.0686 g/100 g。杜仲葉提取物具有良好的抗氧化活性,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),清除自由基效果與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),其清除DPPH·、ABTS+·和·OH的IC50分別為32.89、28.09、235.3 mg/L。對于DPPH·體系,杜仲葉提取物的清除效果要強(qiáng)于BHT而弱于VC;對于ABTS+·的體系,杜仲葉提取物清除能力要略弱于BHT和VC,而對于·OH的體系,其清除效果要強(qiáng)于BHT和VC。杜仲葉不僅具有良好的營養(yǎng)價(jià)值,還含有多種功效成分,具有諸多保健功效,作為新型食品資源在食品開發(fā)及應(yīng)用方面前景廣闊。