利用LPS誘導胚胎期斑馬魚炎癥模型研究羊棲菜多酚抗炎機制

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(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.中國科學院海洋研究所,山東青島 266071)

羊棲菜(Sargassumfusiforme)是一種藥食兩用的褐藻,是我國五種大型養殖經濟海藻之一[1]。羊棲菜的野生資源在我國分布廣泛,主要生長在遼東半島、山東、浙江、福建、廣東以及雷州半島等沿海海域,其中浙江省洞頭縣是我國最主要的養殖基地,被稱為“中國羊棲菜之鄉”。羊棲菜富含多種活性成分,如褐藻糖膠,巖藻黃素,褐藻多酚等。課題組前期研究中,制備了羊棲菜的多酚(SFPC)粗提物,其多酚含量高達88.48±0.30 mg/100 mg,高于其他眾多褐藻[2]。褐藻多酚(phenolic compounds,PC)通過乙酸-丙二酸途徑,以間苯三酚(1,3,5-三羥基苯)為基本結構單元,通過不同聚合度和連接方式,構成一類含有酚羥基的次級代謝產物[3]。近年來褐藻多酚的生物活性逐漸被關注,例如抗氧化[4]、抗炎[5]、抗癌[6]、美白、抑菌[7]等。Cha等[8]從Ecklonia cava中分離出四種褐藻多酚通過評估UVB輻射誘導細胞損傷的斑馬魚體內模型,發現褐藻多酚能顯著減少斑馬魚胚胎中的活性氧和NO產生水平,并能保護胚胎、減少色素沉著。Yoon等[9]從E. cava分離出的phloroglucinol,dioxinodehydroeckol和7-phloroeckol對B16F10小鼠黑色素瘤細胞中酪氨酸酶有明顯的抑制作用。以上研究說明,褐藻多酚在抵抗外界不利因素,如紫外線、腫瘤和老年癡呆等方面具有較強的活性。課題組前期體外巨噬細胞實驗結果表明SFPC具有良好抗炎活性,在200 μg/mL濃度下,NO抑制率可達47.2%,抑制活性高于現有抗炎藥地塞米松[10]。但目前缺乏羊棲菜多酚體內抗炎活性的研究報道,使其高值化應用受限。

活性氧(ROS)和NO在免疫系統信號傳遞中至關重要,但過量的ROS和NO也會導致多種生理生化損害,破壞機體正常代謝功能,甚至導致細胞死亡和組織炎癥[11-14]。熒光探針染料2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)和4-氨基-5-甲氨基-2,7-二氟熒光素二乙酸酯(DAF-FM DA)可被胞內酯酶水解成不能透過細胞膜的DCFH和DAF-FM。細胞內ROS在過氧化物酶存在下氧化DCFH生成有熒光的二氯熒光素(DCF)[15],DAF-FM與NO反應產生強熒光[16],熒光強度可顯示機體細胞內ROS和NO的相對水平。

斑馬魚(Daniorerio)是一種硬骨魚,屬于幅鰭亞綱鯉科短擔尼魚屬[17]。由于其個體小,繁殖能力強,養殖成本低,胚胎透明,易于實驗觀察等優勢被遺傳學、人類疾病研究、藥物研發等領域列為模式生物[18-21]。近年來,已有利用斑馬魚模型評價海洋褐藻多糖、多酚等物質生物活性的相關研究報道[22-23],但未見利用斑馬魚模型研究SFPC抗炎活性的報道。

本實驗在課題組前期利用巨噬細胞模型研究體外抗炎活性的基礎上,首次利用斑馬魚炎癥模型,研究SFPC的體內抗炎活性,為其在功能性食品和化妝品中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜(于2014年5月收獲自浙江省洞頭縣);成年野生AB系斑馬魚 中國海洋大學醫藥學院分子醫學生物學實驗室提供;脂多糖(LPS),吖啶橙,4-氨基-5-甲氨基-2,7-二氟熒光素二乙酸酯(DAF-FM DA),三卡因,2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA) 美國sigma公司;氯化鈉,氯化鉀,氯化鈣,硫酸鎂,鹽酸,亞甲基藍 分析級,上海國藥集團化學試劑有限公司;胚胎培養液(10% NaCl,0.3% KCl,0.3% CaCl2,0.79% MgSO4,0.1%亞甲基藍)。

斑馬魚全自動循環養殖系統 北京愛生科技發展有限公司;SZ61體式顯微鏡 日本奧林巴斯;DMI 6000B倒置熒光顯微鏡 德國Leica 公司;Milli Q純水機 默克密理博實驗室設備(上海)有限公司;FA2004B電子天平 上海天美天平儀器有限公司;冷凍干燥機FD5-2.5 北京金西盟儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SFPC的制備 SFPC的制備方法參考Li等[2]的報道。羊棲菜用蒸餾水沖洗干凈,冷風干燥后,粉碎后過60目篩得羊棲菜海藻干粉,于-20 ℃保存。將海藻干粉按料液比1∶30加入30%乙醇中,在25 ℃的恒溫震蕩搖床中震蕩提取30 min后過濾,取上清加入等體積的乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,將乙酸乙酯旋蒸除去,加入少量蒸餾水復溶,凍干后存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2.2 斑馬魚喂養及胚胎收集 成年野生AB系斑馬魚飼養于全自動循環系統中,水溫設置為(26±1) ℃,照明按14 h/10 h(光照/黑暗)交替進行,每日以豐年蝦(鹵蟲)于早晚各飼喂一次[24]。實驗用胚胎由健康雌雄魚自然交配獲得。收集數百枚胚胎于干凈培養皿中并及時移除排泄物、雜質及未受精胚胎,加入胚胎培養液,轉移于(28.5±1) ℃恒溫培養箱中培養7～9 h,備用。

1.2.3 胚胎給藥 篩選受精且發育至7～9 hpf(hours post fertilization)時期斑馬魚胚胎,移入24 孔細胞培養板中,每孔15枚胚胎,除去殘留培養液后,根據實驗設計,LPS誘導組每孔分別加入終濃度為5、8、10、16、20 μg/mL的LPS,實驗組為LPS+終濃度為50、100、200 μg/mL的SFPC活性物,SFPC用二甲亞砜(DMSO)配制成高濃度貯液,用時用胚胎培養液稀釋至相應濃度工作液且各組中DMSO濃度低于0.5%;空白對照組為含0.5%DMSO的胚胎培養液,給藥方式均是將誘導物或活性物溶于胚胎培養液進行浸泡處理,每個濃度3個孔(平行)[24]。活性物或誘導物給藥后,將24孔板轉移于(28.5±1) ℃恒溫培養箱中繼續培養且每日更換培養液,待后續觀察及檢測。

1.2.4 LPS誘導斑馬魚炎癥模型優化 根據文獻報道[23,25],選擇不同濃度(5、8、10、16、20 μg/mL)LPS,進行單因素的炎癥誘導模型優化。對受精且發育至8～9 hpf胚胎給藥,72 hpf時期進行存活率、心跳速率、ROS生成率的檢測。

1.2.5 SFPC抗炎活性評價 選擇無毒性的羊棲菜安全濃度[10]于7～8 hpf進行胚胎給藥,在(28.5±1) ℃恒溫培養箱中預孵育1 h,然后直接加入終濃度8 μg/mL的LPS誘導濃度進行炎癥誘導,48 hpf進行卵黃囊大小的檢測,72 hpf時期進行胚胎存活率、心跳速率、細胞死亡率、ROS生成率和NO生成率[12]的檢測。

1.2.6 指標測定

1.2.6.1 斑馬魚存活率統計 參考Kim等[26]的報道,各實驗組加藥后注意每日8:30～22:00,每隔2 h觀察胚胎發育狀況,及時移除死亡胚胎并記錄,統計各組胚胎發育至72 hpf時期存活率情況。

存活率(%)=存活胚胎數/總胚胎數×100

1.2.6.2 幼魚卵黃囊大小測定 參考Lee等[23]的報道對各組出膜幼魚進行卵黃囊大小測定。實驗幼魚胚胎達48 hpf時期(徹底脫膜后),用帶攝像頭的體式顯微鏡(25×)對擺位后的幼魚拍照并計算各組與空白組卵黃囊大小之比。

卵黃囊大小(%)=給藥組卵黃囊面積/空白組卵黃囊面積×100

1.2.6.3 幼魚心跳速率檢測 參考Wijesinghe等[27]的報道對各組出膜幼魚進行心跳速率統計。實驗幼魚胚胎達48 hpf時期(徹底脫膜后),對各組幼魚心跳進行30 s人工計數(注意環境溫度在28.5±1 ℃的恒溫條件下),并計算各組與空白組心跳速率之比。

1.2.6.4 斑馬魚幼魚體內熒光染色及各熒光強度的分析 參考鄒婭雪等[28]的報道,對各組胚胎發育至72 hpf幼魚時期,隨機選擇各組胚胎數條對其進行熒光染色。熒光染料包括觀察幼魚體內ROS水平變化的DCFH-DA、觀察幼魚體內NO水平變化的DAF-FM DA以及觀察幼魚體內細胞死亡率的吖叮橙。28.5±1 ℃的恒溫條件下,利用DCFH-DA(20 μg/mL)、DAF-FM DA(20 μg/mL)和吖啶橙(7 μg/mL)對各組幼魚分別避光染色孵育1 h、2 h和30 min。染色孵育后,先用胚胎培養液洗滌幼魚3～5次,后用0.03%三卡因麻醉幼魚,最后將幼魚置于熒光顯微鏡下捕獲相應熒光圖片,并用image J軟件分析、統計相對熒光強度。

ROS生成率/NO生成率/細胞死亡率(%)=給藥組熒光強度/空白組熒光強度×100

1.3 數據分析

所有實驗至少重復三次,結果以means±S.D表示,通過one-way ANOVA對實驗結果進行統計學分析,運用多重比較Turkey檢驗分析實驗數據間的差異性。所示結果中,P<0.05判斷為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 LPS誘導斑馬魚炎癥模型優化結果

2.1.1 LPS誘導濃度對斑馬魚胚胎存活率的影響 如圖1所示,空白組胚胎存活率為100%,且各組行間均無死亡。經過不同實驗濃度LPS處理后,均導致了一定數量的胚胎死亡現象,且胚胎存活率與LPS誘導濃度呈劑量依賴性下降。LPS誘導濃度在5 μg/mL時,誘導組胚胎的存活率與空白組無顯著性差異(P>0.05);而當濃度高于8 μg/mL時,誘導組胚胎的存活率與空白組表現出顯著性差異(P<0.05);且在高濃度(16、20 μg/mL)時,胚胎存活率降至20%和2%,死亡率較高,因此選擇LPS終濃度為5、8、10 μg/mL進行后續實驗。

圖1 LPS誘導濃度對斑馬魚胚胎存活率的影響Fig.1 Effect of LPS-induced concentrationon the survival rate of zebrafish embryo

2.1.2 LPS誘導濃度對斑馬魚心跳速率及ROS生成率的影響 對可以滿足后續炎癥造模指標的各誘導濃度組進行心跳速率和ROS生成率的測定,心跳速率結果如圖2所示,LPS誘導組加快了幼魚心跳速率,表明LPS在該濃度梯度下,斑馬魚出現炎癥表型。在LPS濃度為8 μg/mL時,與空白組相比,斑馬魚心跳速率提高至117.82%(P<0.05),心跳速率最快,炎癥反應最顯著。

圖2 LPS誘導濃度對斑馬魚心跳速率的影響Fig.2 Effect of LPS-induced concentrationon the heart-beating rate in vivo

LPS誘導濃度為5、8、10 μg/mL對斑馬魚幼魚體內ROS水平的影響結果如圖3所示。由圖可知,未經LPS誘導的空白組斑馬魚體內的熒光強度較弱,ROS水平較低,當給予斑馬魚一定濃度的LPS 誘導后,其體內的熒光強度增強,ROS水平增高,即一定濃度的LPS誘導提高了斑馬魚幼魚體內的ROS水平。在此研究中,8 μg/mL LPS誘導濃度可極顯著提高斑馬魚體內的ROS水平近4倍,與Fernando等[29]報道利用10 μg/mL LPS誘導的ROS水平相當,是本研究中LPS誘導炎癥造模的最優濃度。因此,后續實驗選擇最優LPS濃度8 μg/mL進行炎癥造模誘導。

2.2 SFPC抗炎活性評價結果

2.2.1 不同濃度SFPC對斑馬魚卵黃囊大小的影響 斑馬魚從胚胎到幼魚時期無需其他營養供給,可僅利用卵黃囊中營養存活至7 d[30],因此,卵黃囊大小對胚胎發育至關重要。由圖4可知,LPS誘導組的胚胎48 h后發育遲緩,卵黃消耗少,卵黃囊大小比空白組大1.279倍,差異顯著(P<0.05)。而SFPC處理組的卵黃囊大小隨著其濃度的增加逐漸降低,直至高劑量組下與空白組無顯著性差異(P>0.05),說明SFPC能抑制LPS誘導造成的胚胎發育緩慢的炎癥反應,提高胚胎發育速度,使卵黃消耗逐漸恢復正常,表明SFPC對LPS誘導的斑馬魚炎癥反應造成的發育遲緩有抑制作用,進一步證明SFPC能在斑馬魚胚胎受到LPS等外界刺激時起到積極的保護作用。

圖3 LPS誘導濃度對斑馬魚體內ROS生成率的影響Fig.3 Effect of LPS-induced concentration on the ROS production rate in vivo

圖4 不同濃度多酚對斑馬魚胚胎卵黃囊大小的影響Fig.4 Effect of different concentrations of phenolic compounds on the yolk sac size of LPS-induced zebrafish embryos注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

2.2.2 不同濃度SFPC對斑馬魚胚胎存活率和心跳速率的影響 圖5是不同濃度SFPC對LPS誘導的斑馬魚胚胎存活率的結果。從圖5中可以看出,與空白對照組相比,LPS誘導后的72 hpf胚胎存活率顯著下降至30%左右(與圖1無差異),而不同濃度SFPC預處理后,胚胎存活率呈劑量依賴性升高。當SFPC濃度達到200 μg/mL時,其存活率達到66.67%。以上結果表明,SFPC對LPS引起的斑馬魚炎癥胚胎損傷有保護作用,且隨濃度增加,保護作用增強。

圖5 不同濃度多酚對LPS誘導的斑馬魚胚胎存活率的影響Fig.5 Effect of different concentration of phenolic compoundson the survival rate of LPS-induced zebrafish embryos注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

不同濃度SFPC對LPS誘導的斑馬魚心跳速率的結果如圖6所示。由圖可知,LPS誘導組幼魚的心跳速率明顯高于空白對照組,而SFPC處理組則降低了幼魚心跳速率,且當SFPC濃度為200 μg/mL時,其心跳速率已與正常組無顯著性差異(P>0.05)。Wijesinghe等[27]從Laurencia snackeyi提取出來的5β-Hydroxypalisadin B也具有降低LPS誘導的斑馬魚心跳速率增加的效果,被認為是一種潛在有效的抗炎藥。因此,SFPC也具有較強的抗炎活性,可能作為一種潛在的天然抗炎成分。

圖6 不同濃度多酚對LPS誘導的斑馬魚的心跳速率的影響Fig.6 Effects of different concentrations of phenolic compoundson the heart-beating rate of LPS-induced zebrafish注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

圖7 不同濃度多酚對LPS誘導的斑馬魚的細胞死亡的影響Fig.7 Effects of different concentrations of phenolic compounds on the cell death of LPS-induced zebrafish注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

圖8 不同濃度多酚對LPS誘導的斑馬魚的ROS產生量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of phenolic compounds on the ROS production of LPS-induced zebrafish注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

2.2.3 不同濃度SFPC對LPS誘導的斑馬魚細胞死亡的影響 研究表明,細胞死亡對機體穩態的維持有影響,過度的細胞死亡會破壞機體穩態,已有證據表明細胞死亡釋放的大量細胞內溶物可激活免疫系統并引發炎癥[31]。圖7是不同濃度SFPC對LPS誘導后斑馬魚幼魚體內細胞死亡率的影響,其中左圖為用吖啶橙對存活幼魚的體內細胞死亡的特異性染色。由圖可知,LPS誘導后的幼魚體內細胞死亡率顯著性(P<0.05)高于空白組,而用50、100、200 μg/mL SFPC預孵育后,幼魚體內細胞死亡率降低并呈劑量依賴性。從熒光圖像中可明顯看出,空白組幼魚只有少量細胞被熒光染料染色,熒光強度較弱,而LPS誘導組幼魚體內大量細胞結合了熒光染料,熒光強度明顯增強,當預孵育SFPC后則濃度依賴性的改善了幼魚體內細胞死亡狀況,抑制了組織中炎癥反應的進一步增強,表現出良好的抗炎活性。從E. cava中[26]提取的多酚也濃度依賴性降低LPS誘導的斑馬魚幼魚體內細胞死亡率。

2.2.4 不同濃度SFPC對LPS誘導的斑馬魚ROS生成率的影響 圖8是不同濃度SFPC對斑馬魚ROS的影響,其中,左圖為不同條件下斑馬魚的熒光圖片,由圖可見,正常組斑馬魚體內僅有少量ROS,而LPS誘導后斑馬魚體內ROS水平明顯升高,而預孵育50 μg/mL SFPC時即表現出對ROS的顯著性抑制(P<0.05),當SFPC濃度在200 μg/mL時幼魚體內ROS水平已與正常組無顯著性差異(P>0.05),各實驗濃度呈現劑量依賴性抑制作用。Kim等人[26]檢測從E. cava中富集的多酚組分,也發現其對LPS誘導的炎癥斑馬魚的ROS產生量有顯著的劑量依賴性抑制作用。這說明從不同海藻中提取的多酚可能具有相似的抗炎活性,都是良好的天然抗炎成分。

2.2.5 不同濃度SFPC對LPS誘導的斑馬魚NO生成率的影響 圖9是不同濃度SFPC對LPS誘導的斑馬魚的NO產生量的影響。由圖可知,LPS誘導后斑馬魚幼魚體內產生了大量的NO,NO與相應熒光染料反應,表現出強烈的熒光現象,其熒光強度可達空白組2倍左右,而SFPC預處理后劑量依賴性的降低了幼魚體內的NO水平,且100和200 μg/mL的SFPC作用下,斑馬魚NO產生量與空白組無顯著性差異(P>0.05),基本恢復到正常水平。橄欖苦苷是存在于橄欖葉的主要酚類化合物之一,Ryu等[32]從橄欖葉中提取了陸地多酚橄欖苦苷,通過體內斑馬魚炎癥模型發現,其能有效地降低LPS誘導在NO產生,在高濃度300 μmol/L時抑制率達到62%,抗炎效果良好。而從羊棲菜中提取的褐藻多酚在高濃度200 μg/mL時也達到62.65%的抑制率,這表明SFPC和陸地多酚具有相似的抗炎活性。

上述實驗結果表明SFPC具有良好的抗炎活性,其最優濃度為200 μg/mL。該結果與Kim[26]等利用同一模型研究的昆布多酚的抗炎活性相似。

圖9 不同濃度多酚對LPS誘導的斑馬魚的NO產生量的影響Fig.9 Effects of different concentrations of phenolic compounds on the NO production of LPS-induced zebrafish注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

目前,利用斑馬魚模型進行抗炎活性研究已被大量報道,Hwang等[33]利用RAW264.7小鼠巨噬細胞和斑馬魚體內模型證明咖啡因具有明顯的抗炎活性。Sun等[34]利用LPS誘導炎癥研究反式-1,3-二苯基-2,3-環氧丙烷-1-酮的抗炎機制的結果表明,該物質可明顯降低斑馬魚體內ROS和NO產生量,同時以劑量依賴性降低iNOS和COX-2蛋白的表達。有研究表明機體內的一系列病理過程都與ROS的產生有關,ROS的過量產生會導致細胞損傷或炎癥發生[35-36],在本研究中,經LPS誘導后,斑馬魚體內ROS和NO含量明顯升高,但預孵育SFPC后,體內ROS水平明顯降低,同時體內NO水平也顯著降低,因此SFPC的抗炎活性可能與其抗氧化活性有關。

3 結論

本研究通過不同誘導濃度優化得到8 μg/mL LPS誘導的最優斑馬魚炎癥模型,利用該模型探討了SFPC的抗炎活性。一定濃度的SFPC(50、100、200 μg/mL)以劑量依賴性降低LPS誘導后斑馬魚體內NO和ROS的產生,提高胚胎存活率、降低卵黃囊大小及心跳速率。當濃度為200 μg/mL時,斑馬魚胚胎存活率由30%提高至66.67%,顯著降低由LPS誘導所導致的心跳速率和卵黃囊大小的增加,而且NO和ROS生成率降低至75.62%和128.91%,與正常組無顯著性差異,表現出良好的抗炎活性。該實驗結果為SFPC作為一種天然的抗炎劑提供了理論依據。