QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法>測(cè)定葡萄中388種農(nóng)藥殘留

蘭 嵐,周 恒,李雯婷,袁佳佳,苗 水,陳 銘,季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所,上海 201203)

隨著農(nóng)藥種類的擴(kuò)增,使用范圍的日益擴(kuò)大,水果蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品在種植和保存過程中常常受到農(nóng)藥污染,如果人或動(dòng)物攝入的農(nóng)藥量超過每日允許攝入量(ADI),則可能產(chǎn)生毒性反應(yīng),因此亟需建立完善、通用性的農(nóng)殘檢測(cè)平臺(tái)以解決這個(gè)日益突出的食品安全問題[1-4]。QuEChERS前處理方法結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法或液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定農(nóng)藥殘留量具有節(jié)約溶劑、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、選擇性好、定性定量同時(shí)進(jìn)行、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于水果蔬菜的農(nóng)藥殘留分析中[5-10]。

QuEChERS法經(jīng)過十幾年的發(fā)展,衍生出多種精簡(jiǎn)的樣品制備方式。Anastassiades等[11]于2003年首次提出采用QuEChERS前處理法測(cè)定果蔬中多農(nóng)藥殘留,第一次使用了N-丙基乙二胺(PSA)和無水硫酸鎂作為組合吸附劑。Li等[12]使用改良的QuEChERS方法,首次增加了石墨化碳作為凈化填料,采用相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)測(cè)定了菠菜中66種農(nóng)藥殘留量,證實(shí)了石墨化碳可有效凈化含色素較多的食品基質(zhì),減少儀器的維護(hù)頻次。Lehotay等[13]和Wilkowska等[14]總結(jié)和比較了各種改良的QuEChERS前處理方法,針對(duì)不同食品基質(zhì)的特性,以GC-MS、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)為分析儀器,從提取溶劑、緩沖鹽體系和凈化填料的種類和組合效果等進(jìn)行了討論。由于QuEChERS法是通用型快速樣品前處理技術(shù),制備得到的樣品成分仍較復(fù)雜,在農(nóng)藥多殘留研究中,常采用GC-MS法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、LC-MS/MS法和高分辨質(zhì)譜法分析樣品,LC-MS/MS以其適用范圍較廣、在復(fù)雜基質(zhì)下能完成痕量目標(biāo)化合物定性定量分析等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已廣泛用于多農(nóng)殘檢測(cè)中。

葡萄是漿果類農(nóng)產(chǎn)品中貿(mào)易量最大的品種[15],種植范圍大,來源廣泛,種類多樣,易受多種農(nóng)藥污染,常呈現(xiàn)多殘留趨勢(shì),且易超過GB 2763-2016規(guī)定的限度,亟需建立通用性的檢測(cè)方法獲得準(zhǔn)確的結(jié)果[16-18]。葡萄富含果酸、糖類和風(fēng)味物質(zhì),基質(zhì)較為復(fù)雜。本研究在前人研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化QuEChERS方法,在凈化體系中引入硅膠,以有效去除葡萄中強(qiáng)極性成分對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥測(cè)定的干擾。同時(shí),針對(duì)聯(lián)合國(guó)公約和我國(guó)規(guī)定的禁限用農(nóng)藥、對(duì)人類存在“致癌、致畸、致突變”風(fēng)險(xiǎn)的農(nóng)藥以及水果蔬菜樣品中檢出頻率高的農(nóng)藥共計(jì)388種,采用UPLC-MS/MS法在電噴霧正離子模式下進(jìn)行MRM分析,建立了操作簡(jiǎn)便,高效、靈敏度和準(zhǔn)確度高的分析檢測(cè)平臺(tái),以滿足國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)對(duì)葡萄中多農(nóng)藥殘留檢測(cè)的技術(shù)要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

388種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和同位素內(nèi)標(biāo)氘代莠去津 德國(guó)Dr. Ehrensterfer GmbH公司;甲酸、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇 色譜純,德國(guó)Merck公司;10 mol/L甲酸銨、5 mol/L乙酸銨 分析純,德國(guó)SIGMA公司;無水硫酸鎂、無水醋酸鈉 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Zorbax C18色譜柱、核殼柱Poroshell 120 EC-C18安捷倫;硅膠(40～60 μm,60 ?)、C18填料(50 μm,60 ?)和PSA填料(40～63 μm,60 ?) 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1290超高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;API 6500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX公司,配置AB SCIEX數(shù)據(jù)處理軟件、電噴霧源;Sartorius MSU225P-ICE-DU型電子天平 德國(guó)Sartorius;KS 260 basic型振蕩儀 德國(guó)IKA;MS 3 digital型渦旋儀 德國(guó)IKA;Milli-Q型超純水系統(tǒng) 美國(guó)Milipore公司;MULTIVAP 113型氮?dú)獯蹈蓛x 美國(guó)OI-SYS;0.22 μm濾膜 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 提取:按GB 2763《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的可食用部位[19],取葡萄樣品適量,粉碎,取約15.0 g(精確至0.01 g),于50 mL塑料離心管中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液(15 mg/L)100 μL,分別精密加入15 mL1%醋酸乙腈,渦旋使混勻,置于振蕩器上劇烈振蕩5 min(500次/min),以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min;再加入無水硫酸鎂與無水醋酸鈉的混合粉末(4∶1,m/m)7.5 g,立即搖散,置于振蕩器上劇烈振蕩3 min(500次/min),置于冰浴中冷卻10 min,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,上清液待凈化。

凈化:取上清液9 mL,置于已預(yù)先裝有300 mg硅膠、300 mg C18填料、600 mg PSA填料、和900 mg無水硫酸鎂凈化材料的15 mL離心管中,渦旋30 s使充分混勻,再置振蕩器上劇烈振蕩5 min(500次/min)使凈化完全,以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,精密吸取上清液5 mL,氮吹濃縮至約2.5 mL,以0.1 mol/L乙酸銨水溶液定容至5 mL,渦旋混勻,濾過(0.22 μm濾膜),取續(xù)濾液,待檢測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用乙腈或丙酮配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,-20 ℃保存。

內(nèi)標(biāo)溶液:準(zhǔn)確稱取適量氘代莠去津,用乙腈逐級(jí)稀釋成15 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:分別移取一定體積的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,得到1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取混合均勻的空白葡萄樣品15.0 g(精確至0.01 g),按1.2.1項(xiàng)下方法制備至凈化步驟的“以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min”,精密吸取上清液1 mL,氮吹濃縮至約0.4 mL,將適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白基質(zhì)溶液并以0.1 mol/L乙酸銨水溶液定容至1 mL,得到5、10、50、100、200和400 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。以388種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)使用液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),各物質(zhì)的定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱:Poroshell 120 EC-C18液相色譜柱(2.7 μm,3.0 mm×150 mm,美國(guó)Agilent公司);流動(dòng)相:A為水(含0.05%甲酸、5 mmol/L甲酸銨),B為甲醇(含0.05%甲酸、5 mmol/L甲酸銨)。梯度洗脫程序:0～1.00 min,95% A～95% A;1.01～4.00 min,95% A～40% A;4.01～8.00 min,40% A～36% A;8.01～8.50 min,36% A～32% A;8.51～9.00 min,32% A～25% A;9.01～16.00 min,25% A～5% A;16.01～20.00 min,5% A～5% A;20.01～20.10 min,5% A～95% A;流速:0.40 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5.0 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;電噴霧電壓:5500 V;霧化氣(氮?dú)?壓力:50.0 psi;輔助氣壓力:50.0 psi;氣簾氣(氮?dú)?壓力:20.0 psi;碰撞氣(氮?dú)?壓力:7.0 psi;離子源溫度:350 ℃;掃描時(shí)間:50 ms;碰撞室入口電壓:10 V;碰撞室出口電壓:12 V;本研究?jī)H列出135種代表性農(nóng)藥參數(shù)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)(見表1)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別利用Analyst Software和MutiQuant 3.0.2軟件(AB SCIEX)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及處理,Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總和分析。

圖2 乙腈(a)、甲醇(b)、丙酮(c)和乙酸乙酯(d)作為提取溶劑的總離子流圖Fig.2 TIC of the acetonitrile(a),methanol(b),acetone(c)and ethyl acetate(d)as solvents for extraction

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了2種色譜柱,安捷倫Zorbax C18色譜柱(3.5 μm,2.1 mm×150 mm)和核殼柱安捷倫Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm,3.0 mm×150 mm);2種流動(dòng)相體系:乙腈(含0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)-水(含0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)體系和甲醇(含0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)-水(含0.05%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)體系。結(jié)果顯示,使用核殼柱和甲醇-水體系,適用性好,在該梯度洗脫條件下農(nóng)藥出峰均勻,峰形尖銳,分離度好,保留時(shí)間適中。388種農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液總離子流圖見圖1。

圖1 388種農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液總離子流色譜圖Fig.1 TIC of 388 pesticides and internal standard

2.2 提取條件的優(yōu)化

根據(jù)果蔬中農(nóng)殘研究常用的提取溶劑,比較了乙腈、1%冰醋酸乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的提取效率。結(jié)果顯示,選用乙腈作為提取溶劑,對(duì)各農(nóng)藥均有較好的提取效果,對(duì)葡萄基質(zhì)有較強(qiáng)的滲透作用,提取的色素等雜質(zhì)較少,與甲醇、丙酮的提取液相比,乙腈提取液顏色更淺更澄清,LC-MS/MS在m/z 50～1000范圍內(nèi)全掃描得到的總離子圖顯示,乙腈提取液的共萃物更少(圖2)。加入1%冰醋酸酸化,避免堿性或中性環(huán)境不穩(wěn)定的農(nóng)藥的降解和損失,甲草胺、敵瘟磷、辛硫磷和滅線磷的回收率提高了5%～9%。綜合考慮本實(shí)驗(yàn)選擇1%冰醋酸乙腈為提取溶劑。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

凈化可以減少共提取基質(zhì)干擾物對(duì)定量準(zhǔn)確度和儀器靈敏度的影響,對(duì)于多農(nóng)藥殘留分析顯得更為重要。QuEChERS方法采用分散固相萃取(d-SPE)凈化技術(shù),本研究中無水硫酸鎂的用量為900 mg,旨在除去乙腈提取液中的水,保證其他凈化填料的吸附效果,此外還比較了不同配比硅膠、C18、PSA的凈化效果。本試驗(yàn)在50 mL塑料離心管中準(zhǔn)確加入1.5 mL 1 mg/L的388種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,室溫下氮吹至近干,稱取15 g葡萄空白樣品,按樣品同法制備,改變凈化填料配比,在0.10 mg/kg加標(biāo)水平下對(duì)凈化條件進(jìn)行了優(yōu)化。引入硅膠作為凈化填料,可以去除容易沉積在進(jìn)樣口和色譜柱上的糖類及強(qiáng)極性物質(zhì),有利于數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性及儀器的維護(hù)。固定PSA用量為100 mg,分別考察了硅膠添加量為100、200、300、400 mg的回收率,在硅膠添加量為300 mg時(shí),平均農(nóng)藥回收率(86.3%)最佳。C18可有效去除基質(zhì)中的脂類、脂肪類等非極性雜質(zhì),固定PSA、硅膠用量分別為100、300 mg,比較了C18添加量為100、200、300、400 mg的回收率,在C18添加量為300 mg時(shí),平均農(nóng)藥回收率(85.2%)達(dá)到最佳,但C18的用量對(duì)農(nóng)藥回收率影響較小。

表1 葡萄中代表性農(nóng)藥(135種)的MRM質(zhì)譜參數(shù)、線性方程、相關(guān)系數(shù)和添加回收率Table 1 The MS/MS parameters,regression equation,correlation coefficients and recoveries of typical analytes(135 kinds)in grape

PSA對(duì)色素、脂肪酸、有機(jī)酸、酚類的凈化效果最好,固定硅膠、C18用量分別為300、300 mg,比較了PSA添加量為200、400、600、800 mg的回收率,在PSA添加量為600 mg時(shí),平均農(nóng)藥回收率(90.2%)最佳,回收率在70%～110%的農(nóng)藥比例最大,達(dá)到94.3%。硅膠和PSA兩種固相凈化吸附劑的凈化效果見圖3～圖4。最終凈化配比確定為硅膠300 mg、C18300 mg、PSA 600 mg。

圖3 硅膠用量對(duì)388種農(nóng)藥平均回收率的影響Fig.3 Effect of the amount of silicaon the average recoveries of 388 pesticides

圖4 PSA用量對(duì)388種農(nóng)藥平均回收率的影響Fig.4 Effect of the amount of PSAon the average recoveries of 388pesticides

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect)是指樣品中的其他成分對(duì)目標(biāo)分析物離子響應(yīng)強(qiáng)度的影響,即基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確性的干擾,在GC-MS/MS和LC-MS/MS法測(cè)定農(nóng)藥殘留的分析中,基質(zhì)效應(yīng)已得到系統(tǒng)研究[20-23]。388種農(nóng)藥在葡萄基質(zhì)中,61.9%的農(nóng)藥表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。以公式Mi=[(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)-1]×100%來量化評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng),34.8%的農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)明顯(|Mi|>30%),推薦使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限

按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件,測(cè)定濃度范圍為5、10、50、100、200和400 μg/L的葡萄基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,以氘代莠去津?yàn)閮?nèi)標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,388種目標(biāo)化合物在5～400 μg/L線性范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99,見表1)。由于各農(nóng)藥添加回收率均高于60%,采用最低線性濃度水平測(cè)定檢出限,以實(shí)際檢測(cè)到各農(nóng)藥2個(gè)MRM反應(yīng)的最低濃度作為最低檢出濃度,折算各農(nóng)藥檢出限均為0.005 mg/kg。該方法靈敏度較高,可以較好地滿足農(nóng)藥殘留測(cè)定的檢測(cè)限要求。

2.6 方法的回收率和精密度

續(xù)表

續(xù)表

注:*為定量離子。以空白葡萄基質(zhì)樣品中添加回收實(shí)驗(yàn)確定化合物的加標(biāo)回收率,3個(gè)加標(biāo)水平分別為0.01、0.05、0.10 mg/kg,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定7組,加標(biāo)回收率均在60%～120%范圍內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%(n=7),部分代表性農(nóng)藥的回收率和精密度數(shù)據(jù)見表1。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求,方法重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS方法進(jìn)行前處理,引入同位素內(nèi)標(biāo),以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為檢測(cè)儀器,建立了葡萄中多農(nóng)藥殘留的快速篩查檢測(cè)方法,388種農(nóng)藥在3個(gè)添加水平下的回收率為60%～120%,檢出限均為0.005 mg/kg。在方法的建立過程中,重點(diǎn)比較了不同凈化條件下農(nóng)藥的總體回收率水平,確定凈化填料的配比為300 mg硅膠、300 mg C18、600 mg PSA和900 mg無水硫酸鎂,其中硅膠、PSA對(duì)含糖、果酸較多的葡萄的凈化效果較為明顯。該方法簡(jiǎn)便、靈敏度高,結(jié)果穩(wěn)定可靠,經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,滿足葡萄中多農(nóng)藥殘留的日常檢測(cè)要求,且對(duì)其它具有相似化學(xué)成分的食品中的多農(nóng)藥殘留研究具有參考意義。