同位素內標高效液相色譜-串聯質譜法測定糧食及其制品中赭曲霉毒素A、B和C

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(1.廣州市食品檢驗所,廣東廣州 511400;2.武漢輕工大學,湖北武漢 430023;3.廣東美味鮮調味食品有限公司,廣東中山 528437)

赭曲霉毒素(Ochratoxin,OT)是由青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)的真菌所生的一組結構類似的次級代謝產物[1-2],主要包括赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)、赭曲霉毒素B(Ochratoxin B,OTB)和赭曲霉毒素C(Ochratoxin C,OTC),其中赭曲霉毒素A(OTA)的毒性最大[3-5]。OTA是由二氫異香豆素的衍生物和L-β-苯丙氨酸通過肽鍵連接形成的[6],OTB和OTC分別是OTA的非氯取代物和乙酯化物[7],結構式見圖1。OTs廣泛存在于糧食及其制品、花生、大豆及其制品及其他傳統食品中,對人體和動物均具有較強的致癌、致畸、致突變和腎臟病變等毒性[8-13],國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer)將其歸為IIB類致癌物[14]。

圖1 赭曲霉毒素A、B和C的化學結構式Fig.1 Chemical structures of ochratoxin A,B and C

目前,我國對赭曲霉毒素的分析檢測僅著重于OTA,而對OTB及OTC的檢測研究較少[15-16]。我國國家標準GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[17]也僅對OTA做了限量要求,并未對OTB和OTC做限量要求。但近年來,多項研究[18-20]表明,OTC在摧毀免疫細胞功能方面的毒性和破壞性遠遠大于OTA,并且在一定條件下,這3種毒素可以相互轉化。因此,僅考慮OTA對糧食及其制品中的污染遠不能評定該產品的安全性能。

現階段國內對OTA的檢測方法主要有薄層色譜法[21]、酶聯免疫吸附(ELISA)測定法[22]、高效液相色譜(HPLC)法[23]和高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法[15-16,24]。前兩種方法定量準確性差,而HPLC法分析測定時間長,且對基質復雜的樣品定性時易出現假陽性。劉青等[16]用QuEChERS與LC-MS/MS聯用法結合外標法對大米、餅干和花生油等不同基質樣品進行測定,但其前處理過程復雜,結果準確性不高且基質效應明顯。本試驗采用免疫親和柱凈化超高效液相色譜-串聯質譜法,通過對比不同提取溶劑的提取效果和常見固相萃取小柱的凈化效果,同時使用OTA-13C20作為內標,對糧食及其制品OTA、OTB和OTC進行檢測研究,以排除復雜樣品基質的干擾,避開基質標準的繁瑣操作,高效準確地檢測出3種赭曲霉毒素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米、小麥粉和黃豆醬 均購置于當地農貿市場;大米制品(4份)、小麥制品(3份)和醬制品(3份) 均為委托樣品;OTA、OTB標準品(均為10.0 μg/mL) 美國Romer Labs公司;OTC標準品(純度98%) 加拿大TRC公司;U-13C20赭曲霉毒素A標準溶液(10.0 μg/mL) 奧地利Biopure公司;甲醇、乙腈、甲酸(色譜純) 美國Thermo Fisher Scientific 公司;氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉(分析純) 廣州化學試劑廠;超純水 美國Millipore公司Milli-Q超純水系統制得。

赭曲霉毒素免疫親和柱(規格3 mL/60 mg) 美國Beacon公司;Waters Oasis HLB柱和Waters MAX柱(規格均為3 mL/60 mg) 美國Waters公司;Strata-X-C柱和Strata-X-CW柱(規格均為3 mL/60 mg) 美國Phenomenex公司;Waters XEVO TQ-S超高效液相色譜串聯質譜儀 美國Waters公司;Vortex Maxi Mix Ⅱ旋渦振蕩混合器 美國Thermo公司;1-14 K離心機 美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 磷酸鹽緩沖溶液及標準溶液的配制 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的配制[25]:準確稱取氯化鉀 0.2 g、磷酸二氫鉀0.27 g、磷酸氫二鈉1.42 g、氯化鈉8.0 g,用超純水定容至1 L備用。

標準溶液的配制:準確稱取適量OTC標準品,用甲醇配制成10.0 μg/mL標準儲備液,備用。分別準確吸取OTA、OTB、OTC標準溶液和OTA-13C20內標標準品100 μL,用乙腈定容至10 mL,得到濃度均為100 ng/mL的單個標準中間液;分別吸取OTA、OTB和OTC中間液25、50、100、200、250 μL,同時各加入100 μL內標中間液,用乙腈-水溶液(1∶1,V/V)定容至10 mL,得到0.25、0.50、1.0、2.0 和2.5 ng/mL 5個不同濃度的混合標準溶液,此時各標準點中OTA-13C20的濃度均為1.0 ng/mL。

1.2.2 樣品預處理 將樣品研磨后,準確稱取25 g樣品于500 mL錐形瓶中,加入10.0 μg/mL的OTA-13C20內標溶液20 μL(相當于加入200 ng),加入5 g氯化鈉后,加入100 mL乙腈-水溶液(84∶16,V/V),振蕩30 min后,離心(8000 r/min,5 min),吸取上清液2 mL于25 mL PBS中,過赭曲霉毒素免疫親和柱,用10 mL PBS 淋洗2次,棄去全部流出液,吹干免疫親和柱,準確加入2 mL 2% 甲酸-甲醇洗脫,收集全部洗脫液,再用超純水稀釋一倍,過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜,取2 mL于棕色進樣瓶內。

表1 3種赭曲霉毒素及OTA-13C20的多反應監測質譜參數Table 1 Optimized MRM parameters for the determination of ochratoxins and internal standard

圖2 標準溶液的二級質譜圖Fig.2 Secondary mass spectra注:OTA,OTB,OTC and OTA-13C20 的濃度均為100 ng/mL。

注:*為定量離子。加標樣品的處理方法如下:準確稱取25 g樣品于500 mL錐形瓶中,加入一定濃度的赭曲霉毒素標準溶液,于室溫過夜后按上述步驟處理加標樣品即可。

1.2.3 色譜-質譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相A:0.1%甲酸水溶液;流動相B:乙腈。梯度洗脫程序:0～0.2 min,10% B;0.2～1.5 min,10%～90% B;1.5～2.5 min,90% B;2.5～2.7 min,90%～10% B;2.7～3 min,10% B。柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL;流速:0.3 mL/min。

離子源:電噴霧離子(ESI+)源,正離子模式:多反應監測模式(MRM);毛細管電壓:2.5 kV;源溫度:110 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:500 L/h。質譜優化參數見表1。

1.3 數據處理

方法重復性及回收率試驗均做6次重復試驗,各數據的表示形式為平均值+標準偏差,儀器數據采集軟件為MassLynx 4.1,數據分析軟件為TargetLynx 3.1。

2 結果與分析

2.1 方法及條件的選擇

2.1.1 質譜條件的優化 分別配制100 ng/mL的4種赭曲霉毒素標準溶液上質譜儀,進行質譜參數分析。實驗發現,赭曲霉毒素及內標物在正、負離子模式下均有響應,其主要原因是此4種化合物都含有羥基,這樣既能失去質子形成[M-H]-,亦能得到質子形成[M+H]+。但經實驗發現,在正離子模式下干擾較小,響應更高,故本研究采用正離子模式。在電噴霧正離子模式下,分別對3種赭曲霉毒素標準溶液及赭曲霉毒素A內標物進行母離子掃描,選擇[M+H]+作為母離子。對母離子進行二級質譜分析,得到響應最高的化合物作為定量離子,響應次高的化合物作為定性離子,各化合物的二級質譜圖見圖2。同時,對錐孔電壓和碰撞電壓進行了優化,具體優化參數見表1。OTA、OTB和OTC標準MRM圖譜見圖3(a)和陰性樣品加標MRM圖譜見圖3(b)?？梢钥闯?整個檢測過程僅需3 min,且各目標化合物分離效果佳,測量結果定性及定量的準確性高。

圖3 3種赭曲霉毒素的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of 3 kinds of OTs注:(a):赭曲霉毒素混合標準溶液(濃度均為1.0 ng/mL);(b):陰性樣品加標(加標量為8.0 μg/kg);各色譜圖中最高強度的3個峰從左至右依次為OTB,OTA,OTC。

2.1.2 提取溶劑的優化 本試驗探討甲酸-乙腈-水(8∶76∶16,V/V/V)、乙腈-水(84∶16,V/V)、氨水-乙腈-水(8∶76∶16,V/V/V)3種不同溶劑的酸堿性對赭曲霉毒素提取效果的影響。分別對空白樣品進行濃度均為5.0 μg/kg的提取回收率試驗,結果見表2。

表2 不同溶劑對赭曲霉毒素的提取回收率結果(%,n=6)Table 2 The recoveries of differentsolvents on ochratoxins(%,n=6)

表3 不同固相萃取柱對赭曲霉毒素的提取回收率結果(%,n=6)Table 3 The recoveries of different SPE columns on ochratoxins(%,n=6)

表4 赭曲霉毒素的標準曲線、檢出限及定量限(n=6)Table 4 Standard curves,LODs and LOQs of ochratoxins(n=6)

由表2可知,乙腈-水對OTA、OTB和OTC的提取效果均較理想,回收率在97.80%～108.85%之間;其次是氨水-乙腈-水,其對OTA和OTB的提取效果較佳,提取回收率分別為108.75%和90.70%,但對OTC的提取回收率為135.6%,效果不理想;最后是甲酸-乙腈-水,其對OTA的提取效果較好,但對OTB和OTC的提取效果不好,均在50%以下?？赡茉蚴荗TA、OTB和OTC均含有羥基,在含有氨水的提取溶劑中易發生離子化,增強了OTC的基質效應;在有甲酸的提取溶劑中,OTB及OTC的溶解性能較差;而在乙腈-水的中性提取溶劑中,3種赭曲霉毒素均能較好地保留于提取溶劑中。因此,綜合對3種赭曲霉毒素提取率考慮,最終選擇乙腈-水(84∶16,V/V)為提取溶劑。

2.1.3 固相萃取柱的選擇 分別選取免疫親和柱、Waters Oasis HLB、Strata-X-C、Strata-X-CW和Waters MAX固相萃取柱等5種不同的固相萃取柱,對加標量為5.0 μg/kg的樣品進行萃取效果比較,提取回收率結果見表3。

從表3可以看出,免疫親和固相萃取柱對3種赭曲霉毒素進行凈化效果最佳,提取回收率為93.83%～107.34%;其次為Waters MAX柱和Waters Oasis HLB柱,提取回收率分別為72.02%～78.73%和63.86%～67.04%,Strata-X-C柱和Strata-X-CW柱兩種固相萃取柱提取效果較差,提取回收率為5.84%～73.16%。雖然Strata-X-C柱和Strata-X-CW柱均有反相和弱陰離子交換的模式,但免疫親和柱與其他固相萃取柱相比對OT具有更強的特異性,且不容易受到其他雜質的干擾,因此免疫親和固相萃取柱回收率更高。故選用免疫親和固相萃取柱對樣品進行凈化分析。

2.2 方法學驗證

2.2.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 按1.2.1中標準溶液的配制方法,在1.2.3儀器條件下依次進樣10 μL進行分析,在0.25～2.5 ng/mL線性范圍內,以赭曲霉毒素的濃度為橫坐標(x),以OTA、OTB和OTC色譜峰與OTA同位素內標色譜峰OTA-13C20的峰面積比值為(y),通過Targetlynx 3.1繪制標準曲線,采用內標法定量,標準曲線如表4所示。

表5 不同樣品在低、中和高3水平加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 5 Recoveries and relative standard deviations for spiked foods(n=6)

根據3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)分別定為檢出限(LOD)和定量限(LOQ),計算出3種赭曲霉毒素的檢出限和定量限見表4。

表4表明,3種赭曲霉毒素在優化后的條件下,其濃度與峰面積均呈現良好的線性關系,R2在0.999以上,且赭曲霉毒素A的檢出限為0.018 μg/kg,定量限為0.059 μg/kg,均低于國家標準GB 5009.96-2016第三法規定的檢出限(0.1 μg/kg)和定量限(0.3 μg/kg)。此外,本方法同樣測定出OTB和OTC的檢出限和定量限,分別為0.013、0.042、0.003、0.011 μg/kg。

2.2.2 加標回收率試驗及精密度 在陰性大米、小麥粉和黃豆醬中添加低、中、高三個水平的OTA、OTB和OTC混合標準溶液,每個水平平行測定6次,考查本方法的回收率及精密度,其結果如表5所示。結果表明,所選3種基質的赭曲霉毒素在三個水平的加標回收率在80.50%～107.08%之間,相對標準偏差(RSD)介于0.14%～4.94%,說明此方法對同時檢測3種赭曲霉毒素的結果可靠。

2.3 實際樣品的檢測

對委托的10份糧食及其制品按照本方法進行OTA、OTB和OTC含量測定,發現1份大米樣品中OTA有檢出,其含量為0.35±0.01 μg/kg,檢出濃度低于國標法的測定低限(1.0 μg/kg)結果如圖3所示。

圖3 陽性樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of one typical positive sample

3 結論

本實驗研究建立了以OTA-13C20做為內標,同時測定3種赭曲霉毒素的分析方法。對于不同基質樣品研磨后加入適量OTA-13C20做為內標,以乙腈-水(84∶16,V/V)為提取溶劑時,提取回收率最優,為97.80%～108.85%;經免疫親和柱對OTA、OTB和OTC進行富集、凈化的提取回收率最好,為93.83%～107.34%。用同位素內標液相色譜-串聯質譜法進行檢測分析,結果表明,此方法前處理操作簡便、重現性好、對3種赭曲霉毒素的凈化效果佳,可消除基質對樣品中目標物的干擾,儀器分析時間短,僅需3 min即可得知實驗結果。本方法測定赭曲霉毒素的低、中和高3水平加標回收率在80.50%～107.08%之間,RSD為0.14%～4.94%,并且OTA的檢出限(0.018 μg/kg)和定量限(0.059 μg/kg)均低于國家標準GB/T 5009.96-2016第三法,同時,OTB和OTC的檢出限和定量限分別為0.013、0.042 μg/kg和0.003、0.011 μg/kg。對委托的10種糧食及其制品進行測定,發現僅一份樣品有低劑量檢出,其OTA的濃度為(0.35±0.01) μg/kg。此方法快速簡便、凈化效果佳靈敏度較高,可檢測低濃度的赭曲霉污染的糧食及其制品,適用性較強,定性(量)準確,各項指標均能夠滿足實際樣品中赭曲霉毒素A、B和C的定性和定量檢測要求,為保障日后的糧食及其制品的安全提供了重要依據和技術支持。