LCMS-IT-TOF測定不同脂肪酸結構食用油中的羰基化合物

江 鑫,陳倩媛,俞文韜,胡 妍,曹 君

(海南大學食品科學與工程學院,海南海口 570228)

食用油是指在制作食品過程中使用的植物或動物油脂,由于受到原材料、加工工藝的限制,常見的食用油多為植物油,其中包括菜籽油、花生油、玉米油、葵花籽油、亞麻籽油、紫蘇油、橄欖油、油茶籽油、大豆油、芝麻油等。在人們日常生活中,食用油不僅在食物增加色、香、味上起到重要作用,還是人體不可缺少的營養來源之一。其中甘油三酯是油脂中最重要的營養物質,甘油三酯可以在體內脂肪酶的作用下發生水解,最終得到甘油和各種脂肪酸[1]。脂肪酸可以按飽和程度分為三類,分別是飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)[2]。經營養學和臨床醫學研究表明,不飽和脂肪酸在維持人體健康方面起著重要的作用[3]。

在食用油加熱過程中,由于長時間高溫處理食用油中的甘油三酯會發生氧化、水解、聚合等一系列反應,導致其品質下降,甚至產生對人體有害的成分[4]。其中羰基化合物是一種重要的二級氧化產物,它可以作為食用油品質的一個重要指標[5]。研究表明,醛酮類化合物對人的眼睛、皮膚和呼吸道有著強烈的刺激作用,而且甲醛和乙醛已被確認是致癌物或可疑致癌物。其它長鏈的醛酮類物質是一些風味物質,并被列為一種可以添加的食用香精,如己醛、庚烯醛、辛醛、壬醛、癸二烯醛等,但這些物質大多數閾值較低[6],其含量一旦超過某個閾值就會產生令人不愉快的氣味[7],甚至會對人體產生一些未知的危害。與此同時,在食物中羰基化合物的主要來源就是油脂[8],油脂中所產生的活性羰基化合物很可能與其它物質發生反應,形成不同的化合物,包括Strecker醛[9]、丙烯酰胺[10]、雜環胺[11]等,這些變化可能對食品具有很多負面的影響[12]。目前國內對此類二級氧化產物的研究并不多,多數研究都是針對油煙中揮發性醛、酮對室內空氣污染的研究,對于殘留在油脂中的醛酮類化合物關注較少,因此對醛類及其相關的羰基化合物的研究是十分必要的。想要研究這些羰基化合物,首先要對其進行定性和定量分析,根據國內外的一些相關文獻,比較常用的測定羰基化合物的方法有分光光度法[13]、氣相色譜法[14]和高效液相色譜法[15]。

本實驗對加熱前后油茶籽油、玉米油和亞麻籽油的油樣進行甲酯化處理,再采用氣相色譜法對每種食用油的脂肪酸含量和變化進行測定,對加熱后的油樣進行2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)衍生化處理,再采用LCMS-IT-TOF進行測定分析,該方法相對簡單、有效,可以獲得優異的分離效率和特定信息[16]。本文希望通過實驗得到高溫下油酸、亞油酸和亞麻酸形成的特征性醛酮,為建立一種新的油脂氧化程度的評價方法提供參考;并對希望通過研究加熱處理后食用油中脂肪酸含量變化和生成羰基化合物的種類的關系,探究脂肪酸種類對生成羰基化合物種類的影響,為推測羰基化合物的形成過程提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶籽油、玉米油及亞麻籽油 當地超市;正己烷、甲醇、乙腈 色譜純,美國Fisher公司;GLC-463脂肪酸甲酯混標 標準品,美國Nu-Chek-Prep公司;乙酸甲酯、無水甲醇、甲醇鈉、草酸、無水硫酸鈉、濃鹽酸、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)、二氯甲烷、二甲基硅油 均為國產分析純。

Agilent 7890A氣相色譜儀(配有全自動進樣器與FID檢測器) 美國安捷倫公司;高效液相色譜-離子阱飛行時間質譜儀(LCMS-IT-TOF) 日本島津公司;TDL-5-A型低速離心機 上海安亭科學儀器;XO-5200DTD型超聲波清洗機 南京先歐儀器制造有限公司;SHA-B型雙功能水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇億通電子有限公司;DSY-VI型水浴氮吹儀 北京東方精華苑科技有限公司;ME104E型精密天平 METTLER TOLEDO;XW-80A型漩渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;SZ-6B型單缸電炸爐 佛山市思博詩電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油脂加熱實驗 日常烹飪過程中180 ℃也是較為常用的煎炸溫度,為使食用油充分氧化得到較為全面的羰基化合物種類,選擇加熱24 h的油樣進行測定。取新開封的油茶籽油、玉米油和亞麻籽油各500 mL,分別加入不銹鋼容器內,置于裝有二甲基硅油的可控溫電炸爐中,在180 ℃硅油浴中加熱24 h,取出50 mL油樣裝入50 mL帶蓋離心管中進行快速冷卻,待冷卻至室溫,置于-18 ℃冰箱中保存待用,所測指標需在一周內測完。

1.2.2 脂肪酸含量測定

1.2.2.1 樣品的甲酯化 采用堿法甲酯化[17]:取適量油樣加入1.5 mL的正己烷和40 μL乙酸甲酯,再加入100 μL甲醇鈉-甲醇溶液,在37 ℃下反應20 min,然后置于-20 ℃下冷凍10 min,取出后迅速加入60 μL的草酸乙酸甲酯溶液,離心(3600 r/min,5 min)取上清液,將適量上清液用無水硫酸鈉柱(除去其中的水分)過濾至進樣瓶中,氮氣吹干,加正己烷進行復溶,進行氣相色譜分析。

1.2.2.2 氣相色譜條件 檢測器:FID檢測器;進樣量:1 μL,自動進樣;色譜柱:CP-Sil 88熔融石英毛細管柱(100 m×0.25 mm,0.2 μm);進樣口溫度:250 ℃;程序升溫:45 ℃時保持4 min,然后以13 ℃/min的升溫速率將溫度升至175 ℃保持此溫度27 min,后以4 ℃/min的升溫速率將溫度升至215 ℃保持35 min,總測定時間為86 min;檢測器溫度:250 ℃;氫氣流速為30 mL/min;空氣流速為300 mL/min,氮氣流速為30 mL/min,壓力:24.52 psi;總流量:29.4 mL/min[18]。脂肪酸分析采用Agilent Chemstation軟件對氣相色譜數據進行分析處理,以脂肪酸甲酯標準品為對照,采用面積百分比法確定脂肪酸的百分含量(以峰值面積的百分比表示)。

1.2.3 羰基化合物的LCMS-IT-TOF分析

1.2.3.1 DNPH反應液的制備 參考Cao的方法[19],稱取0.3 g DNPH晶體,先加入10 mL甲醇溶解,再加入3 mL 6 mol/L HCl溶液混勻,超聲(200W)5 min,用甲醇定容到100 mL容量瓶中,蓋緊,靜置,待用。

表2 三種食用油脂肪酸組成變化情況(%)Table 2 The changes of three kinds of fatty acid composition(%)

注:“-”表示未檢出;SFA,Saturated fatty acids,飽和脂肪酸;PUFA,Polyunsaturated fatty acids,多不飽和脂肪酸;MUFA,Monounsaturated fatty acids,單不飽和脂肪酸;同一行不同小寫字母表示有顯著性差異,P<0.05。1.2.3.2 樣品的衍生化 根據Seppanen的方法[20]進行改良,稱取適量氧化后油脂放入10 mL的具塞試管中,加入DNPH反應液2 mL,渦流使之充分接觸,然后置于40 ℃的水浴恒溫振蕩器中,充分振蕩反應1 h。反應結束后,取出樣品冷卻至室溫,加入2 mL甲醇-水(75∶25,v/v)溶液渦流混勻,置于離心機中,4200 r/min離心5 min,取上層甲醇層,重復上述步驟,反復提取3次,合并上層液體,加入適量二氯甲烷進行萃取,取二氯甲烷層用氮氣吹干,加2 mL乙腈定容,取1 mL樣品通過0.22 μm的有機濾膜進入進樣瓶中,進行液相色譜分析。

1.2.3.3 LCMS-IT-TOF對樣品中羰基化合物的定性分析 液相色譜條件:色譜柱Water ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);柱溫40 ℃;流速0.3 mL/min;進樣體積:1 μL;流動相A:甲醇溶液,流動相B:超純水;梯度洗脫條件見表1;二極管陣列檢測器掃描波長270～500 nm,最終選擇檢測波長為360 nm。

表1 LCMS-IT-TOF的梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase gradient elutionconditions of LCMS-IT-TOF

MS條件為:ESI離子源,正離子和負離子掃描,質量范圍150～400 Da。霧化氣(Nebulizing Gas)流速:1.5 L/min;檢測電壓(Detector Volta):0.5 kV;曲線脫溶劑管(CDL)和加熱模塊(Heat Block)溫度:200 ℃;RP真空度:97 Pa;TOF真空度:4.1×10-4PA。對主要色譜峰物質進行精確質量數分析,并結合相關文獻[21]數據比對進行化學成分確認。

1.2.4 統計分析 實驗進行至少3個平行,數據以均值±標準偏差(mean±SD)的形式表達。One-way ANOVA用來比較數據間的顯著性差異,并用 Duncan’s進行多重比較,P<0.05則表示數據間有統計學差異。采用SPSS 20.0對實驗數據進行單因素方差分析,采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸組成的變化

將未加熱和加熱后的樣品進行甲酯化后,進行脂肪酸含量測定,通過面積百分比法對3種植物油的脂肪酸組成和變化進行了分析和比較,見表2。

從表2中可以看到,油茶籽油、玉米油和亞麻籽油含有的主要脂肪酸分別是油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)和亞麻酸(C18∶3)。油茶籽油含油酸高達79.08%,其次是亞油酸大約占8.8%,亞麻酸不足1%;玉米油含亞油酸高達55.05%,其次是油酸大約占28.08%,亞麻酸僅有1.07%;亞麻籽油所含亞麻酸高達56.57%,其次是油酸大約占20.22%,亞油酸也有14.1%。據文獻可知,植物油中不同種類脂肪酸發生氧化速度有所不同,通常情況下,脂肪酸中雙鍵數量越多,越容易與空氣發生氧化,花生四烯酸、亞麻酸、亞油酸、油酸的相對氧化速率之比大概為40∶20∶10∶1[22]。油茶籽油中油酸百分含量最高,是亞油酸百分含量的近10倍,但其氧化速率比亞油酸慢10倍,在含量和速率的共同影響下,亞油酸百分含量小幅下降1.8%,油酸百分含量上漲0.96%,γ-亞麻酸百分含量幾乎下降為0;玉米油中亞油酸百分含量是亞麻酸含量的50多倍,所以在氧化過程中處于優勢地位,亞油酸百分含量下降約3%,油酸百分含量不及亞油酸,反應速率慢,因此油酸百分含量上漲2.5%,亞麻酸百分含量僅有小幅下降;亞麻籽油中亞麻酸百分含量最高,反應速率又最快,因此亞麻酸百分含量下降4.05%,亞油酸百分含量小幅上漲0.3%,油酸百分含量上漲2.4%。雖然在食用油高溫加熱過程中,有些飽和脂肪酸的百分含量有所上漲,但也僅僅是因為這些脂肪酸氧化損失較少,在其他不飽和脂肪酸損失較多的情況下,這些飽和脂肪酸占有的百分含量升高了,并非這些飽和脂肪酸含量有所增加,因此從變化趨勢上看,油茶籽油中油酸的氧化明顯高于其他兩種油中油酸的氧化,玉米油中亞油酸的氧化明顯高于其他兩種油中亞油酸的氧化,亞麻籽油中亞麻酸的氧化明顯高于其他兩種油中亞麻酸的氧化。

表3 LCMS-IT-TOF定性結果Table 3 LCMS-IT-TOF qualitative result

2.2 羰基化合物的定性結果

將油茶籽油、玉米油和亞麻籽油高溫加熱加速氧化24 h后,進行衍生化處理,得到衍生后的樣品進行LCMS-IT-TOF測定,得到360 nm波長下的DAD圖,見圖1。

圖1 油茶籽油(a)、玉米油(b)和亞麻籽油(c)的DAD色譜圖Fig.1 DAD chromatogram of camellia seed oil(a),corn oil(b)and flaxseed oil(c)

通過對油茶籽油、玉米油和亞麻籽油的DAD圖進行分析,確定每一個峰所對應的質荷比(m/z),再與各種已知的羰基化合物的質荷比(m/z)進行比對,初步得到3種食用油中所含全部羰基化合物的種類,見表3。

通過LCMS-IT-TOF分析測定,一共有32個峰被檢出,通過對質荷比(m/z)的校對[23],我們可以確定第一個峰(1.62 min)對應物質為衍生試劑DNPH,后續31個有效峰中,共確認出26種羰基化合物-DNPH,分別是甲醛-DNPH、乙醛-DNPH、丙烯醛-DNPH、丙酮-DNPH、丙醛-DNPH、丁烯醛-DNPH、丁酮-DNPH、丁醛-DNPH、戊烯醛-DNPH、戊醛-DNPH、戊酮-DNPH、己烯醛-DNPH、己醛-DNPH、己酮-DNPH、庚二烯醛-DNPH、庚烯醛-DNPH、庚醛-DNPH、辛烯醛-DNPH、辛醛-DNPH、壬烯醛-DNPH、壬醛-DNPH、壬酮-DNPH、癸二烯醛-DNPH、癸烯醛-DNPH、癸醛-DNPH、十一烯醛-DNPH。

通過觀察3種食用油的DAD色譜圖發現,由于3種食用油中均含有油酸、亞油酸和亞麻酸,因此彼此間的峰型有很多共同點,但仔細觀察后發現3種食用油DAD圖在一些峰的峰面積上還是略有不同,為了更直觀的比較三種食用油中產生羰基化合物的區別,將其中15種主要醛的峰面積進行了比較,如圖2所示。

續表

圖2 三種食用油主要醛峰面積比較Fig.2 Comparison of main aldehyde peak areas of three edible oils

注:“-”表示未檢出,*代表已與標準品進行比對。油茶籽油和玉米油在20 min前較為相似,但20 min后油茶籽油產生的羰基化合物的種類明顯多于玉米油,并且在峰面積上也明顯高于玉米油,結合兩種油在脂肪酸組成上的差異以及脂肪酸的變化情況,可以得出油酸可能是20 min以后出現的辛醛、辛烯醛、壬烯醛、壬醛、壬酮、癸烯醛、癸醛和十一烯醛中某些羰基化合物的前體物質;玉米油和亞麻籽油相比15 min前的羰基化合物種類基本相同,但亞麻籽油在8～13 min之間的峰面積明顯高于玉米油,由于在衍生化時取用的油樣質量大致相同,所以亞麻酸可能是8～13 min中出現的丙烯醛、丙醛、丙酮、丁烯醛、丁醛和丁酮中某些羰基化合物的前體物質,與此同時,亞麻籽油中含有一種在油茶籽油和玉米油中都沒有出現的庚二烯醛,所以可以猜測庚二烯醛與亞麻酸密切相關;而玉米油在15～20 min這段時間內出現的戊醛、戊酮、己烯醛、己醛、己酮和庚烯醛以及26 min左右出現的癸二烯醛的峰面積明顯高于其他兩種油,因此亞油酸很可能是這其中某些羰基化合物的前體物質。

圖3 油茶籽油5種特征羰基化合物質譜圖Fig.3 Mass spectrometry of 5 characteristics carbonyl compounds of camellia seed oil注:左1辛醛-DNPH,右1壬醛-DNPH,左2壬烯醛-DNPH,右2癸烯醛-DNPH,左3十一烯醛-DNPH。

由圖2可知,油茶籽油中辛醛、壬烯醛、壬醛、癸烯醛和十一烯醛的峰面積遠遠高于其他兩種油,因此推測這5種羰基化合物是油茶籽油(高油酸油)中的特征羰基化合物,見圖3。Min等[24]研究油酸自動氧化產生的氫過氧化物繼續分解主要產生癸烯醛和辛醛,Kanavouras[25]研究油酸自氧化產生的辛醛和癸烯醛遠高于其他脂肪酸,這與本文測得結果一致,同時本文還發現十一烯醛也是油酸氧化中非常重要的特征烯醛,油酸在氧化過程中,過氧基會在C8、C9、C10、C11位形成,進一步裂解后形成辛醛、壬醛、壬烯醛、癸烯醛和十一烯醛[26]。

由圖2可知,在玉米油中戊醛、戊酮、己醛、庚烯醛和癸二烯醛的峰面積均高于其他兩種油,雖然沒有大幅領先油茶籽油,但考慮到油茶籽油中亞油酸也發生了大量氧化,甚至高于其油酸的氧化,因此油茶籽油中也會含有較高含量的亞油酸生成的羰基化合物,但玉米油中油酸的氧化程度遠不及油茶籽油,因此由油酸氧化生成的羰基化合物含量就明顯低于油茶籽油,這也是區分油茶籽油和玉米油特征醛的關鍵。綜上所述,這5種羰基化合物是玉米油(高亞油酸油)中的特征羰基化合物,見圖4。可見亞油酸在氧化過程中,過氧基會在C9、C12、C13、C14位形成,進一步裂解后形成戊醛、戊酮、己醛、庚烯醛和癸二烯醛。Frankel[27]報道亞油酸及高亞油酸油的氧化產物多為戊醛、己醛、庚烯醛和辛烯醛,與本文基本相符,除辛烯醛含量較少外,其他幾種醛均為特征醛,除此之外,本文還發現癸二烯醛含量較高,Patsioura等[28]研究表明,亞油酸的一種含有10位和12位雙鍵的氫過氧化物繼續分解生成共軛二烯,這也極有可能是產生較多癸二烯醛的原因。Martínez等[23]研究發現,亞油酸最主要的特征醛之一,己醛的氧化途徑是通過13-氫過氧化物衍生而來。

圖4 玉米油的5種特征羰基化合物質譜圖Fig.4 Mass spectrometry of 5 characteristics carbonyl compounds of corn oil 注:左1戊醛-DNPH,右1戊酮-DNPH,左2己醛-DNPH,右2庚烯醛-DNPH,左3癸二烯醛-DNPH。

由圖2可知,亞麻籽油中丙酮、丙醛、丁酮、丁醛峰面積遠遠高于油茶籽油和玉米油,而庚二烯醛更是僅存在于亞麻籽油中,因此這5種羰基化合物是亞麻籽油(高亞麻酸油)中的特征羰基化合物,見圖5。可見亞麻酸在氧化過程中,過氧基會在C12、C15、C16位形成,進一步裂解后形成丙酮、丙醛、丁酮、丁醛和庚二烯醛。與ω-6脂肪酸衍生的羰基化合物相比,來自ω-3脂肪酸的氫過氧化物通常產生具有較短鏈長的羰基化合物[29]。對于鏈烷醛形成的模式,丙醛(C3鏈烷醛)僅由ω-3脂肪酸產生,而己醛(C6鏈烷醛)主要來自ω-6脂肪酸。丙醛和己醛的形成分別對應于ω-3和ω-6脂肪酸的第一個n位雙鍵的斷裂,與此同時反式-2,4-庚二烯醛也被Suh報道,在ω-3脂肪酸中被檢測到[30],而反式-2,4-癸二烯醛在ω-6脂肪酸中被觀察到。

圖5 亞麻籽油的5種特征羰基化合物質譜圖Fig.5 Mass spectrometry of 5 characteristics carbonyl compounds of flaxseed oil注:左1丙醛-DNPH,右1丙酮-DNPH,左2丁醛-DNPH,右2丁酮-DNPH,左3庚二烯醛-DNPH。

3 結論與討論

本研究通過對油茶籽油、玉米油和亞麻籽油高溫加熱前后的脂肪酸測定,得到三種食用油不同的脂肪酸組成以及變化情況,再利用LCMS-IT-TOF對三種加熱后油樣產生的羰基化合物進行定性分析,得到每種油產生的全部羰基化合物。由于三種食用油的脂肪酸組成存在差異,導致三種食用油高溫加速氧化后產生的羰基化合物種類略有不同,對比三種食用油所產生的羰基化合物的種類和峰面積,找出了不同脂肪酸組成的食用油氧化后產生的特征羰基化合物。高油酸食用油的特征羰基化合物為辛醛、壬烯醛、壬醛、癸烯醛、十一烯醛;高亞油酸食用油的特征羰基化合物為戊醛、戊酮、己醛、庚烯醛、癸二烯醛;高亞麻酸食用油的特征羰基化合物為丙醛、丙酮、丁醛、丁酮、庚二烯醛。將特征羰基化合物產量的高低作為一個新指標,判斷該脂肪酸類型食用油的氧化程度高低,具有一定的科學性,并且可以與傳統的酸價、過氧化值及茴香胺值一同對油脂氧化程度做出一個更全面、更準確的判斷。與此同時,根據這些特征羰基化合物的種類,可以判斷油酸氧化主要在8、9、10、11號碳位產生氫過氧化物,亞油酸主要在9、12、13、14號碳位產生氫過氧化物,亞麻酸主要在12、15、16號碳位產生氫過氧化物。氫過氧化物繼續裂解產生不同的羰基化合物,這也證明脂肪酸組成對于所產生羰基化合物的種類起到決定性作用。