南極磷蝦副產物酶解蛋白胨工藝優化及實際應用

,2,2,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306)

目前制備蛋白胨多采用酶解的方法,目前制備蛋白胨多以單酶水解的方式,如王錫念[19]等利用風味蛋白酶、堿性蛋白酶水解鮟鱇魚皮,所選取的風味蛋白酶具有內切蛋白酶和外切蛋白酶兩種特性,因此酶切位點會更多,效果更好;堿性蛋白酶是內切蛋白酶,其主要酶切位點為Tyr、Phe、Trp[20-21]。有報道表明復合酶解效果高于單酶解,復合酶解包括復合酶分段水解和復合酶組合水解[22]。

本實驗用南極磷蝦副產物作為原料,利用風味蛋白酶、堿性蛋白酶進行復合酶分段水解制備蛋白胨,以水解率的大小作為衡量蛋白胨的得率的指標。利用風味蛋白酶和堿性蛋白酶分段水解,對比考察溫度、復合酶比、時間、pH(為了簡化工藝,整個反應過程中保持pH不變)對水解率的影響,對比大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌在南極磷蝦蛋白胨、牛肉膏蛋白胨上的生長情況,測定其OD600,并繪制生長曲線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 捕撈于南極海域FAO48.2區,南極磷蝦副產物包括南極磷蝦的蝦殼、蝦足、蝦頭等,儲存在-20 ℃冰箱冷凍備用;風味蛋白酶(酶活為2000000 U)、堿性蛋白酶(酶活為2000000 U) 無錫亨捷未央貿易有限公司;大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球 上海海洋大學微生物實驗室;甲醛(36%～38%)、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸溶液 國藥集團化學試劑有限公司(上海)。

超聲波清洗器(KQ5200E) 上海一恒儀器有限公司;高壓滅菌鍋(LDZF-30KB-III) 上海四科儀器設備有限公司;高速冷凍離心機(H2050R) 長沙湘儀有限公司;凱氏定氮儀(K06) 上海晟聲自動化分析儀器有限公司;無菌操作臺(SZX-1) 上海浦東躍欣科學儀器廠;氨基酸自動分析儀(L-8800) 日本日立公司;紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦副產物制備蛋白胨工藝流程 南極磷蝦副產物→解凍→加水均質(1∶4)→復合酶分段保溫水解(先加入堿性蛋白酶,水解一定時間后再加入風味蛋白酶)[22]→滅酶(100 ℃,30 min)→冷卻→離心(10000 r/min,30 min)→抽濾→南極磷蝦酶解液→凍干(-80 ℃,36 h)→南極磷蝦蛋白胨

1.2.2 加入風味蛋白酶時間的確定 準確稱取10 g解凍后的南極磷蝦副產物,與蒸餾水1∶4比例混合并均質。先加入堿性蛋白酶,分別在超聲水解0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h后,再加入風味蛋白酶繼續水解。堿性蛋白酶:風味蛋白酶為1∶1,總加酶量為1%,調節pH為至7.0,超聲功率40 kHz溫度50 ℃。整個反應時間為5.0 h后,100 ℃滅酶,靜置冷卻,10000 r/min的條件下離心30 min,比較最終水解率,以確定加入風味蛋白酶最適時間。

1.2.3 單因素實驗 準確稱取10 g解凍后的南極磷蝦副產物,與蒸餾水1∶4比例混勻、均質。調節pH為至7.0,溫度50 ℃,在超聲功率為40 kHz下超聲,先加入堿性蛋白酶,經上文1.2.2方法確定時間后再加入風味蛋白酶繼續水解。堿性蛋白酶:風味蛋白酶為1∶1,總加酶量為1%,整個反應時間為5.0 h后,100 ℃滅酶,靜置冷卻后,10000 r/min離心30 min,測定氨基酸態氮的含量,依次考察溫度、時間、復合酶比、pH對水解率的影響。

設定單因素的水平依次為溫度(40、45、50、55、60、65 ℃),整個反應時間(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 h),復合酶比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3),pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)。

1.2.4 酶解工藝的正交實驗 在單因素試驗的基礎上,以水解率為考察指標,對水解溫度、時間、復合酶比和pH等影響因素進行綜合考察,采用正交試驗進一步優化南極磷蝦副產物的水解工藝條件。正交試驗設計結果如表1所示。

表1 酶解工藝的正交試驗因素水平設定Table 1 Factors and levels for orthogonalexperiment of enzymatic hydrolysis

1.2.5 水解率的測定 水解率的計算公式為:

氨基酸態氮:根據GB5009 235-2016,測定南極磷蝦蛋白胨中氨基酸態氮的含量。總氮量:采用GB 5009.5-2016凱氏定氮法。利用全自動凱氏定氮儀測定南極磷蝦副產物(蝦殼、蝦足等均質后混勻)中總氮量[23]。

1.2.6 南極磷蝦蛋白胨中游離氨基酸的種類及含量 根據GB/T 5009.124-2003處理樣品,用氨基酸自動分析儀測定南極磷蝦蛋白胨中的游離氨基酸種類及含量。

1.2.7 南極磷蝦蛋白胨培養微生物的最適濃度 選取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 g/L濃度的南極磷蝦蛋白胨溶液為培養基,以1%的接種量,分別接種大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus),測定其OD600,確定每種微生物生長的最適濃度。

1.2.8 牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨微生物培養的效果比較 將大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌種活化后,以1%的接種量,分別接種到牛肉膏蛋白胨培養基中和南極磷蝦蛋白胨(濃度根據1.2.7中確定)培養基中,在37 ℃的條件下,恒溫培養24.0 h,每間隔2.0 h取一次菌液,以未接種的牛肉膏蛋白胨培養基、南極磷蝦蛋白胨培養基為空白對比,測定OD600值,以OD600為縱坐標,以時間(h)為橫坐標,分別繪制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨和南極磷蝦蛋白胨上的生長曲線。

1.3 數據處理

應用Microsoft Excel 2016和SPSS Statistics 21.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 加入風味蛋白酶時間的確定

從圖1可以看出,加入堿性蛋白酶后,若水解時間少于1.5 h就加入風味蛋白酶,則水解率較小;若在1.5 h后加入風味蛋白酶,則水解率較高且波動不大。因此確定加入風味蛋白酶的適宜時間為1.5 h。

圖1 加入風味蛋白酶的時間對水解率的影響Fig.1 Effect of time of adding flavor protease on hydrolysis rate

2.2 單因素實驗

2.2.1 溫度對水解率的影響 由圖2可知,當溫度小于60 ℃時,水解率呈現遞增趨勢,溫度大于60 ℃時水解率趨于平穩且略有下降,在60 ℃時水解率最高。風味蛋白酶的有效反應溫度是30～60 ℃,堿性蛋白酶的有效反應溫度是40～60 ℃[22],堿性蛋白酶的有效反應溫度范圍較風味蛋白酶小,兩種蛋白酶有效反應的最高溫度為60 ℃,選擇溫度不宜大于60 ℃,所以選擇40、45、50、55、60 ℃進行正交實驗。

圖2 溫度對水解率的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis rate

2.2.2 水解時間對水解率的影響 由圖3可知,水解時間小于5 h時,水解率隨水解時間的增加呈現上升趨勢。當水解時間大于5 h后,水解率變化較為緩慢且略有下降。從時間和能耗耗方面考慮,繼續酶解會增加成本,反應時間過長也可能因起蛋白酶變性,所以選擇3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h進行正交實驗。

圖3 水解率隨時間的變化Fig.3 Hydrolysis rate change with time

2.2.3 復合酶比對水解率的影響 由圖4可知,在風味蛋白酶∶堿性蛋白酶=3∶1、2∶1、1∶2、1∶3條件下進行水解,其水解率均小于風味蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶1時的水解率。因此,適宜的水解復合酶比為1∶1。

圖4 復合酶比對水解率的影響Fig.4 Effect of complex enzyme ratio on hydrolysis rate

圖5 pH對水解率的影響Fig.5 Effect of pH on hydrolysis rate

2.2.4 pH對水解率的影響 由圖5可知,隨著pH的升高,水解率呈現下降趨勢,在pH=5.0時水解率最高。堿性蛋白酶適宜的pH范圍6.0～10.0,風味蛋白酶適宜的pH范圍5.0～9.0,風味蛋白酶作用的適宜pH較堿性蛋白酶低,經過堿性蛋白酶作用后,為風味蛋白酶提供了更多底物,低pH更有利于風味蛋白酶的作用,本實驗適宜的水解pH為5.0。

2.3 酶解工藝正交實驗結果

由表2可知,各個因素對水解率影響的大小順序為:A>C>D>B。酶解工藝的最佳組合為A5B5C3D1,即溫度60 ℃、時間5 h、復合酶比1∶1、pH=5.0,在此條件下進行驗證實驗,得出的最大水解率為28.38%。由表3酶解工藝方差分析表可以得出,酶解溫度對水解率有顯著性影響(P<0.05)。

表2 酶解工藝正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment of enzymatic hydrolysis

表3 酶解工藝的方差分析Table 3 Analysis of variance of enzymatic hydrolysis

注:*:表示差異顯著,P<0.05。

表4 南極磷蝦蛋白胨中游離氨基酸的種類及含量Table 4 Types and contents of free aminoacids in antarctic krill peptone

2.4 南極磷蝦蛋白胨中游離氨基酸組成及含量

測定南極磷蝦蛋白胨中游離氨基酸的種類和含量如表4所示。南極磷蝦蛋白胨含有17種游離氨基酸,總游離氨基酸含量為(2968.83±35.1) mg/100 g。

2.5 南極磷蝦蛋白胨培養微生物的最適濃度

由圖6可知隨著南極磷蝦蛋白胨濃度逐漸增加,微生物的OD600值為遞增趨勢,當到達某一濃度,OD600值較穩定。當培養大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌的南極磷蝦蛋白胨培養基濃度分別為3.5、5.0、4.0、4.5 g/L時,OD600值最大,大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌生長速率最高,因此培養大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌的最適濃度分別為3.5、5.0、4.0、4.5 g/L。

圖6 南極磷蝦蛋白胨溶液培養微生物的適宜濃度Fig.6 Suitable concentration of culturingmicroorganisms in antarctic krill peptone solution

2.6 微生物培養效果比較

2.6.1 大腸桿菌(E.coli)生長曲線的測定 圖7為大腸桿菌在牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨上的生長曲線,在0～7 h處于延滯期,生長較慢、分裂遲緩。在8～14 h生長速度比較快,這時的大腸桿菌生長速率最快,這個階段屬于對數期,這個時期的的菌株最適宜做微生物接種的種菌。15 h之后大腸桿菌的菌體數量達到平穩,菌落群數最多,這個階段為穩定期,營養物質減少,活的細胞數目較多。測得大腸桿菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大0.077左右。

圖7 大腸桿菌生長曲線Fig.7 The growth curve of E.coli

2.6.2 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生長曲線的測定 圖8金黃色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨上的生長曲線,在0～8 h處于延滯期,生長比較慢。在10～14 h生長速度比較快,這時的金黃色葡萄球菌生長速率最快,這個時期為對數生長期,這個時期的的菌株最適宜做微生物接種的種菌。14 h菌落總數最多,這個時期為穩定期,在這個時期培養基中微生物賴以生存的營養成分減少、微生物會產生有毒有害成分。測得金黃色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大0.08左右。

圖8 金黃色葡萄球菌生長曲線Fig.8 The growth curve of Staphylococcus aureus

2.6.3 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)生長曲線的測定 圖9為枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨上的生長曲線,0～7 h處于延滯期,分裂遲緩。在8～14 h生長速度比較快,這時的枯草芽孢桿生長速率最快,這個階段屬于對數期,這個時期的的菌株最適宜做微生物接種的種菌。15 h之后枯草芽孢桿菌的菌體數量達到平穩,菌落群數最多,這個階段為穩定期,營養物質被減少,活的細胞數目較多。測得枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大0.076左右。

圖9 枯草芽孢桿生長曲線Fig.9 The growth curve of Bacillus subtilis

2.6.4 蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)生長曲線的測定 圖10為蠟狀芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨、南極磷蝦蛋白胨上的生長曲線,在0～9 h處于延滯期內生長比較慢。在10～14 h生長速度比較快,這時蠟狀芽孢桿菌生長速率最快,這個時期為對數生長期,這個時期的的菌株最適宜做微生物接種的種菌。14 h之后處于穩定期,活細胞數目最多,在這個時期培養基中的營養物質開始減少、并產生乳酸等有機酸類,降低pH,菌體會生成一些有毒有害物質,導致之后會出現菌體自溶等現象。測得蠟狀芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大0.089左右。

圖10 蠟狀芽孢桿菌的生長曲線Fig.10 The growth curve of Bacillus cereus

3 結論

以南極磷蝦副產物為原料,利用風味蛋白酶、堿性蛋白酶分段水解制備蛋白胨,最佳酶解工藝條件為:溫度60 ℃、pH5.0、加入堿性蛋白酶水解1.5 h后,再加入風味蛋白酶繼續水解解3.5 h,復合酶比1∶1,在此條件下進行驗證實驗,水解率為28.38%,得到的南極磷蝦蛋白胨富含17種游離氨基酸,總游離氨基酸含量為(2968.83±35.1) mg/100 g。以南極磷蝦蛋白胨溶液為培養基培養大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌的最適濃度分別為3.5、5.0、4.0、4.5 g/L,其在此濃度下OD600值最大,生長速率最高。測得4種微生物在牛肉膏蛋白胨中的OD600僅比在南極磷蝦蛋白胨中大8%左右,說明南極磷蝦蛋白胨可以替代牛肉膏蛋白胨作為微生物培養基的成分。本文為南極磷蝦副產物的綜合利用提供了一定的理論依據。