萱草花類黃酮提取、分析及其抗氧化性研究

(上海應用技術大學香料香精技術與工程學院,上海 201418)

萱草,別名黃花菜、金針花、鹿蔥等,為百合科(Liliaceae)萱草屬(Hemerocallis)多年草本植物[1]。萱草作為藥食兩用花卉,其根、莖、葉、花均可入藥,其花苞通過干制得到金針菜,在中國已有2000多年的食用歷史[2]。萱草花中含有多種生物活性物質,如類黃酮、內酰胺、類胡蘿卜素、生物堿和甾體[3-5]等。類黃酮具有抗氧化、抗抑郁、抑菌消炎等生物活性[6-7]。研究萱草花中類黃酮提取工藝和分析檢測抗氧化成分,有利于開發萱草花中類黃酮資源,可提升萱草花經濟價值,拉長萱草產業化生產鏈。

類黃酮的常用提取方法有溶劑提取、微波提取、超聲輔助提取、酶解、超臨界流體萃取、雙水相萃取分離、半仿生提取等[8]。超聲輔助提取利用超聲的空氣化作用和機械震蕩作用對細胞壁進行破壞,促進植物細胞中類黃酮溶出[9],可縮短提取時間,提高提取率[10]。李曉軍[11]和蔣紅芝等[12]利用超聲輔助提取分別在金銀花和砂糖橘果皮中以較高的提取率提取出了類黃酮。類黃酮分析鑒定方法主要有紅外光譜、高效液相色譜、高效液相色譜-質譜聯用以及核磁共振等[13]。高效液相色譜具有易操作、靈敏度高和穩定性好等優點。張元梅[14]等采用高效液相色譜法同時檢測了柑橘中18種類黃酮物質,孫麗芳等[15]采用該方法分析了蘆葦葉中10種類黃酮,均得到較好的分析結果。目前測定抗氧化性多為體外清除自由基實驗,如清除DPPH自由基、清除羥自由基、總還原力的測定、清除超氧自由基等。岳秀潔[16]研究了三種辣木葉提取物的抗氧化性,分別測定了清除DPPH和·OH自由基能力,三種辣木葉都有較好的體外抗氧化能力,但都低于對照組VC。孫澤飛[17]的研究發現,牡丹花具有較高的清除DPPH自由基和ABTS自由基能力。目前國內對萱草花的研究主要集中在其藥理活性或者色素穩定性研究,對于萱草花中類黃酮提取、分析和抗氧化性的研究較少。

本文擬采用響應面法優化萱草花類黃酮的超聲輔助提取工藝,建立分析萱草花類黃酮的高效液相色譜方法,分析不同品種萱草花類黃酮含量,并以DPPH·清除率和·OH清除率為指標分析其抗氧化性。本研究旨在探究萱草花的抗氧化活性和其成分組成,為萱草花中類黃酮的利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

萱草花 本研究選用品種為“杜鵑”、“火鳳凰”、“極地之光”的萱草花為原料,其顏色分別為黃色、橙紅色和紫色,2017年06月采摘在上海應用技術大學植物園采摘上述品種萱草,-70 ℃真空冷凍干燥,粉碎后過40目篩備用;兒茶素、表兒茶素、蘆丁、異槲皮素、槲皮素、柚皮素、山奈酚、橙皮素和白楊素(≥98%)標準品 德思特生物技術有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 分析純,上海國藥集團有限公司;抗壞血酸、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、甲酸 均為分析純,上海國藥集團試劑有限公司;雙氧水(≥30%)、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇 均為分析純,上海探索平臺試劑公司;乙腈 色譜純,上海探索平臺試劑公司。

高效液相色譜儀Agilent 1260 Infinity、DAD檢測器 安捷倫科技有限公司;SB-5200 DTD超聲水浴鍋 寧波新芝生物科技有限公司;紫外分光光度計UV-2000 上海儀電分析儀器有限公司;FD-2C真空冷凍干燥機 上海比郎儀器制造有限公司;層析柱(22 mm×300 mm) 上海探索平臺試劑有限公司;RE-5203旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;500 g搖擺式粉碎機 青州市新航機械設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 萱草花類黃酮的提取工藝流程 萱草花粉末→石油醚除去油脂→超聲輔助提取→減壓旋蒸→萱草花類黃酮提取液

其中,超聲輔助提取按照1.2.2中的條件進行,減壓旋蒸的壓力為0.1 MPa,溫度為50 ℃。

1.2.2 響應面法優化超聲輔助提取萱草花類黃酮 本文研究超聲提取工藝條件對類黃酮提取率的影響,根據前期單因素實驗結果,確定超聲提取功率、超聲時間和乙醇體積分數這三個因素對萱草花類黃酮提取率起顯著作用,采用響應面法優化確定最優提取工藝,其因素水平如表1所示。

表1 超聲輔助提取萱草花類黃酮的響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surfaceexperiment for the extraction of flavonoids from daylilyflowers by ultrasonic assisted extraction

1.2.3 萱草花類黃酮提取率的測定

1.2.3.1 蘆丁標準曲線制作 參考Yang等[18]的方法,并作稍許改動。準確稱量0.02 g蘆丁標準品,用70%乙醇溶液溶解,定容于100 mL容量瓶中,制得0.2 mg/mL母液。分別從母液中量取1、2、3、4、5、6、7 mL于20 mL具塞試管,加入0.6 mL質量分數為5%的Na2NO2溶液,搖勻后靜置6 min,加入0.6 mL質量分數為10%的Al(NO3)3溶液,搖勻后靜置6 min,加入5 mL質量分數為10%的NaOH溶液,然后加去離子水定容,搖勻,靜置15 min后在510 nm處測定吸光度(OD)值,以70%乙醇溶液作為空白對照。以蘆丁濃度為橫坐標,吸光度(OD510nm)為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。

1.2.3.2 類黃酮提取率的計算 參考馬小虎等[19]索氏提取馬蓮種皮總黃酮方法,測定萱草花中總黃酮含量。稱取一定量萱草花粉末于索氏提取器中,95 ℃回流,至索氏提取管無色為止。將提取液轉移至100 mL容量瓶中,定容,按照1.2.3.1步驟測定吸光度值,計算萱草花中總黃酮含量m1(mg/g)。萱草花類黃酮提取率計算公式為:

萱草花提取液中類黃酮質量m2=(n×C×V)/m

式中,m為萱草花粉末質量(g),m1為萱草花中總黃酮含量(mg/g);m2為萱草花提取液中類黃酮含量(mg/g);n為稀釋倍數;C為萱草花提取液濃度(mg/mL);V為萱草花提取液體積(mL)。

1.2.4 萱草花類黃酮提取液成分分析

1.2.4.1 標準溶液的配制 準確稱量兒茶素5.5 mg、表兒茶素5.2 mg、蘆丁3.9 mg、異槲皮素2.2 mg、槲皮素2.2 mg、柚皮素2.5 mg、山奈酚2.5 mg、橙皮素2.5 mg、白楊素2.2 mg于25 mL棕色容量瓶中,用80%甲醇溶液超聲輔助溶解并定容,作為標準儲備液,于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4.2 高效液相色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A:水(0.1% 甲酸,V/V),B:乙腈,流速為0.8 mL/min,柱溫35 ℃,進樣體積10 μL;洗脫程序如表2所示。經紫外掃描確定蘆丁、異槲皮素、槲皮素、山奈酚、白楊素的檢測波長為254 nm;兒茶素、表兒茶素、橙皮素、柚皮素的檢測波長為280 nm。

表2 高效液相色譜梯度洗脫程序表Table 2 High performance liquidchromatography gradient elution schedule

1.2.4.3 方法學考察 線性關系:用80%甲醇溶液按照倍數1、2、10、20、50、100逐級稀釋并定容到10 mL容量瓶中,配制6個標準液。按照1.2.4.2色譜條件進行分析,以出峰面積為橫坐標(X),質量濃度(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,計算各個類黃酮標準曲線的線性回歸方程及決定系數(R2);精密度:選取低濃度(2 μg/mL)和高濃度(50 μg/mL)兩個濃度點的標準品按1.2.4.2色譜條件分別分析6次,用相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)表示精密度;回收率:在萱草花類黃酮提取液中,分別添加10 μg/mL和50 μg/mL類黃酮標準液,平行制備三個樣品,按照1.2.4.2色譜條件進行分析,根據測定結果中類黃酮成分含量,計算回收率;檢出限、定量限測定:將標準液逐級稀釋,按照1.2.4.2色譜條件進行分析,測定各個類黃酮的信噪比(S/N),當S/N=3即為檢出限(LOD),當RS/N=10即為定量限(LOQ)。

1.2.4.4 樣品中類黃酮含量的測定 將萱草花類黃酮提取液過0.22 μm濾膜,按照1.2.4.2色譜條件進行分析,采用外標法計算萱草花中類黃酮含量。

1.2.5 萱草花類黃酮提取液體外抗氧化性測定 本文采用DPPH·清除率和·OH清除率兩種方法評價萱草花類黃酮提取液的體外抗氧化性。

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測定 參照Wada等[20]的方法并略微修改。取2 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液分別與2 mL樣品稀釋液和VC溶液(2、5、10、20、50、100 μg/mL)混合,避光反應30 min,在517 nm處測吸光度,記為A1;對照組為2 mL乙醇代替提取液,加入2 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液,搖勻,避光反應30 min,在517 nm處測定吸光度,記為A2;空白對照為取各個濃度類黃酮提取液2 mL,加2 mL乙醇,避光反應30 min,在517 nm測定吸光度,記為A0。萱草花類黃酮提取液的DPPH自由基清除能力利用IC50處的樣品和VC濃度折算成VC當量。

1.2.5.2 ·OH清除能力測定 參照Smirnoff等[21]、鄧乾春等[22]的方法并略作修改,雙氧水和二價鐵發生Fenton反應生成·OH,加入水楊酸捕捉·OH并產生有色物質,在510 nm處有最大吸收峰。取2 mL樣品稀釋液和VC溶液(40、60、80、100、200、400 μg/mL)分別加入0.5 mL濃度為9 mmol/L的水楊酸,然后加入0.5 mL濃度為9 mmol/L的硫酸亞鐵,最后加入0.5 mL濃度為8.8 mmol/L雙氧水啟動反應,反應30 min,在510 nm測定吸光度,記為A1。空白對照用0.5 mL水替代雙氧水,測定吸光度記為A0。本底吸收為用水代替類黃酮提取液,測定吸光度記為A2。萱草花類黃酮提取液的·OH清除能力利用IC50處的樣品和VC濃度折算成VC當量。

1.3 數據分析

用Design Experet 8.0軟件進行響應面試驗及分析,數據采用Origin Pro 9.0和SPSS 18.0軟件進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 標準曲線建立及總黃酮含量測定結果

把一系列的蘆丁濃度(X)和吸光度(Y)做擬合,得到回歸方程為Y=11.927X+0.0013,R2=0.9992。通過標準曲線計算得萱草花中總黃酮含量m1為51.69±1.29 mg/g。

2.2 響應面優化萱草花類黃酮提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計及結果 用Design Experet 8.0軟件設計響應面試驗,共有17個實驗點,其中12個為分析點,5個中心點來評估實驗誤差。自變量X1為乙醇體積分數(%)、X2為超聲功率(W)、X3為超聲時間(min),響應值Y為類黃酮提取率(%)。響應面試驗設計及結果如表3所示。

表4 響應面回歸模型方差分析表Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

注:**表示極顯著(P<0.01);*表示顯著(P<0.05)。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiment

2.2.3 響應曲面分析 通過多元回歸模型,進行兩因素交互分析,可以得到兩因素對類黃酮提取率影響的響應面及等高線圖,如圖1所示。

對于響應面來說,其坡面越陡峭,則兩因素水平改變對響應值影響就越大。等高線圖中一條曲線上的數值是相同的,其呈橢圓形或排列緊密,則表明兩因素對響值影響較大,其呈圓形或排列疏松,則兩因素對響應值影響較小[23-24]。由圖1(a)可知,其響應面比較陡峭,乙醇體積分數和超聲功率的變化對響應值影響較大,當超聲時間處于最佳值時,乙醇體積分數(X1)和超聲功率(X2)的等高線呈橢圓形,說明兩者交互作用比較顯著;由圖1(b)可知,其響應面比較陡峭,乙醇體積分數和超聲時間的變化對響應值影響較大,超聲功率處于最佳值時,乙醇體積分數(X1)和超聲時間(X3)的交互曲線呈橢圓形,說明兩者交互作用比較顯著;由圖1(c)可知,超聲功率(X2)和超聲時間(X3)等高線呈圓形,則兩因素交互效果不明顯。

2.2.3 最優條件及驗證 利用軟件Design-Expert 8.0對響應面模型進行解析,得到最優條件為乙醇體積分數為73.16%,超聲功率為194.78 W,超聲時間為22.44 min,預測類黃酮提取率為91.73%。根據實際操作稍作修改,則最優條件為:乙醇體積分數為75%,超聲功率198 W,超聲時間23 min,在此工藝條件下,進行3次重復實驗,得到實驗萱草花中類黃酮提取率為91.15%,相對標準偏差(RSD)為0.686%,與預測值較接近,說明該模型能較好地預測萱草花類黃酮提取率。

2.3 基于HPLC法萱草花類黃酮組分及其含量分析

2.3.1 方法學考察結果

圖2 各因素交互作用對萱草花類黃酮提取率影響的響應面和等高線Fig.2 Response surface and contour line of the interaction of various factors on the extraction rate of flavonoids from daylily flowers

表4 響應面回歸模型方差分析表Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

注:**表示極顯著(P<0.01);*表示顯著(P<0.05)。

表5 9種標準品的線性方程、線性系數、濃度范圍、檢出限、定量限、精密度和回收率Table 5 Linear equation,linear coefficient,concentration range,detection limit,quantitative limit,precision and recovery rate of nine standard products

表6 三種萱草花中類黃酮含量Table 6 Flavonoid content in three kinds of daylily flower

注:同列字母不同表示顯著性差異(P<0.05)。2.3.1.1 線性范圍、檢出限、定量限 兒茶素、表兒茶素、蘆丁、異槲皮素、柚皮素、槲皮素、橙皮素、山奈酚、白楊素的線性方程如表5所示,結果表明在線性范圍內,線性良好。9種類黃酮的檢出限和定量限如表5所示,檢出限0.09～0.44 μg/mL,定量限為0.26～1.32 μg/mL,其中異槲皮素的檢出限和定量限最低,分別為0.09、0.26 μg/mL。

2.3.1.2 精密度實驗結果 如表5所示,9種類黃酮檢測的相對標準偏差RSD<5%,說明該方法精密度良好。

2.3.1.3 回收率實驗結果 計算9種類黃酮的加標回收率,回收率結果如表5所示,除槲皮素在10 μg/mL時的加標回收率為89.69%和橙皮素在50 μg/mL時的加標回收率為87.45%外,其他7種類黃酮的回收率都在90%以上,說明所建立高效液相色譜方法的回收率良好。

2.3.2 三種萱草花類黃酮組成及其含量 將三種萱草花的類黃酮提取液進行高效液相色譜分析,柚皮素含量液相出峰較低,未在圖中標出,其液相色譜圖見圖2,三種萱草花中類黃酮的含量見表6。

圖2 三種萱草花類黃酮提取液的液相色譜圖Fig.2 High Performance liquid chromatography offlavonoid extracts from three kinds of daylily flowers注:a、b分別為254、280 nm液相色譜圖。

由圖2液相色譜圖可知,三個品種萱草花中的類黃酮能夠清晰分離。通過高效液相色譜法對三個品種萱草花的類黃酮提取液進行分析,結果如表6所示。由表6可知,萱草花中提取液中成分為兒茶素、表兒茶素、蘆丁、異槲皮素和柚皮素,其中蘆丁和兒茶素含量較多。三種萱草花中蘆丁含量最高,對蘆丁而言,“火鳳凰”的含量最高(5068.93 μg/g),是“杜鵑”含量的1.4倍、“極地之光”的2.2倍;對兒茶素而言,“火鳳凰”中兒茶素是“杜鵑”9.5倍、是“極地之光”的8.4倍。

2.3 三種萱草花類黃酮提取液的抗氧化活性

配制三個品種萱草花的不同濃度的提取液,測定DPPH·清除率和·OH清除率,結果如圖3所示。由圖3a可知,萱草花類黃酮有較強的清除DPPH自由基能力,且在一定濃度范圍內萱草花類黃酮對DPPH·清除能力呈顯著的量效關系,這與唐巧玉等[25]和張燦等[26]研究類黃酮抗氧化的結論相似。不同品種的萱草花的清除DPPH自由基能力不同,“杜鵑”、“ 極地之光”和“ 火鳳凰”這三種萱草花(每g干重)的清除DPPH自由基能力分別等效于10.88、24.22、17.55 mg VC。測定一系列不同濃度的類黃酮和VC的清除·OH自由基能力,分別得出IC50并折算成VC當量,“杜鵑”、 “極地之光” 和“火鳳凰”三種萱草花(每g干重)等效于41.97、38.02、35.38 mg VC。在孫澤飛[15]對牡丹花類黃酮研究的過程中發現,植物抗氧化能力不是單獨某種化合物的作用,而是存在植物體內所有類黃酮共同作用的結果。類黃酮結構上為多羥基酚類物質,有很強的供氫能力,萱草花類黃酮具有清除DPPH·和·OH能力,可作為一種天然抗氧化劑的原料。

圖3 萱草花提取液的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of the extracts from daylily flower

3 結論

本研究通過響應面法優化出萱草花類黃酮提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數75%、超聲功率198 W、超聲時間23 min,在此條件下類黃酮的提取率為91.15%。本研究建立的萱草花類黃酮高效液相色譜分析法的回收率在80%～110%之間,相對標準偏差RSD<5%。采用此方法分析三個品種萱草花,得到其主要類黃酮為兒茶素、表兒茶素、蘆丁、異槲皮素和柚皮素,其中蘆丁和兒茶素含量較多。本研究測定了三個品種萱草花的體外抗氧化性,“杜鵑”、“ 極地之光”和“ 火鳳凰”三種萱草花(每g干重)DPPH·清除能力等效于10.88、24.22、17.55 mg VC,·OH清除能力等效于41.97、38.02、35.38 mg VC,表明萱草花可作為一種天然抗氧化劑資源被深度開發利用。