杏仁皮單寧提取工藝優化及其DPPH自由基清除活性

杜 凱,馬養民,2,*,郭林新

(1.陜西科技大學化學與化工學院,陜西西安 710021;2.陜西省輕化工助劑重點實驗室,陜西西安 710021)

山杏(Armeniacasibirica)又名西伯利亞杏,薔薇科杏屬植物,廣泛分布于我國北方地區,是改善生態環境、提高經濟效益和社會效益的經濟資源樹種[1]。由于杏仁具有鎮咳平喘、潤腸通便、抗炎鎮痛的效果及抗腫瘤、降血糖、抑制胃蛋白酶活性等藥理作用[2-3],杏仁加工產品的種類和數量快速增加,作為杏仁產業的下腳料杏仁皮也越來越多,這已經成為杏仁加工企業很難處理的苦惱問題。目前研究主要集中在杏仁皮黃酮、黑色素、果膠等方面[4-6],而杏仁皮單寧相關的研究還未見報道。

單寧是一類分子量為500～3000的多元酚類化合物,廣泛存在于植物的果、葉、皮中[7]。單寧可以與蛋白質結合產生沉淀[8],廣泛應用于醫療、皮革和化妝品等行業[9-10]。有關山杏單寧的研究鮮有報道,且僅限于其葉片單寧的提取及單寧成分的分析檢測[11-13]。經過前期預試驗發現杏仁皮中富含單寧,杏仁皮作為工業生產的廢棄資源,尚未被開發,如能將其加以利用,將會帶來極大的社會經濟效益。

本研究以杏仁加工企業所產生的廢棄物杏仁皮為原料,進行單寧的提取,旨在建立一條最優的杏仁皮單寧提取工藝,并對其單寧抗氧化活性進行初步測試,為資源充分開發利用提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏仁皮 陜西天壽杏仁食品有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH自由基) 上海華藍化學科技有限公司;維生素C 天津博迪化工有限公司;其余試劑均為國產分析純。

HF200型酶標儀 北京華安麥科生物技術有限公司;R502B型旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司;DK-98Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司;SHZ-Ⅲ型循環水式真空泵 上海申生科技有限公司;BS2202S電子秤 北京市科技電光儀器廠;BS224S型分析天平 格瑞恩科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏仁皮單寧提取 采用水浴回流法提取杏仁皮單寧[14]。稱取5 g杏仁皮粗粉于圓底燒瓶中,加入一定體積分數的乙醇溶液,一定溫度下回流提取一段時間,過濾,重復提取三次,合并濾液,將其真空濃縮后待測。

1.2.2 單寧得率的測定 采用絡合法測定單寧得率[15]。取待測濃縮液加水約至60 mL于35 ℃水浴溫熱15 min。精密移取4.00 mL 1.000 mol/L醋酸鋅溶液于100 mL容量瓶中,加入2.80 mL氨水,搖勻使白色沉淀溶解,緩慢加入已預熱的待測濃縮液,邊加邊搖,加完后繼續振搖1 min,置原水浴保溫30 min,間歇振搖數次,待反應完畢,冷卻至室溫,定容,混勻后過濾,精密移取濾液10.00 mL于錐形瓶中,并加入150 mL水、12.5 mL pH=10的NH3-NH4Cl緩沖溶液和3滴鉻黑T指示劑。以0.02631 mol/L EDTA·2Na滴定至溶液由酒紅色變為藍色。單寧得率按下式計算:

單寧得率(%)=[0.1556×(VZn×CZn-10×VEDTA×CEDTA)]/W×100

式中:0.1556指每毫升1 mol/L的醋酸鋅溶液平均消耗單寧0.1556 g;VZn為移取鋅離子體積量,mL;CZn為鋅離子物質的量濃度,mol/L;VEDTA為EDTA消耗體積,mL;CEDTA為EDTA濃度,mol/L;W為樣品的質量,g。

1.2.3 單因素實驗 固定提取時間90 min、提取溫度60 ℃、乙醇體積分數50%,考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g/mL)對單寧得率的影響;固定料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度60 ℃、乙醇體積分數50%,考察提取時間30、60、90、120、150 min對單寧得率的影響;固定料液比1∶20 (g/mL)、提取時間90 min、乙醇體積分數50%,考察提取溫度40、50、60、70、80 ℃對單寧得率的影響;固定料液比1∶20 (g/mL)、提取時間90 min、提取溫度70 ℃,考察乙醇體積分數30%、40%、50%、60%、70%對單寧得率的影響。

1.2.4 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上,以杏仁皮單寧的得率為響應值,以料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數4個因素為自變量進行Box-Behnken響應面實驗設計,優化杏仁皮單寧提取工藝,其實驗因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 杏仁皮單寧抗氧化活性測試 采用DPPH法測定[16],用95%乙醇配制成濃度為0.2 mg/mL的DPPH溶液。將最佳工藝下所得的杏仁皮單寧配制成單寧濃度為0.5 mg/mL的待測液,同時以VC作陽性對照。用二倍稀釋法得到待測液濃度依次為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81 μg/mL,然后將待測液分別與DPPH溶液避光反應30 min,在517 nm處使用酶標儀測定溶液的吸光度。并通過下式計算DPPH自由基清除率。

式中:E為自由基清除率;A0為DPPH加乙醇的吸光度;A1為DPPH加樣品的吸光度;A2為樣品加乙醇的吸光度。

1.2.6 數據處理 所有實驗重復三次,取平均值。Origin 9.0軟件進行繪圖,SPSS 21.0軟件的單因素方差進行變量之間差異的統計分析(當P<0.05時,差異顯著)。使用Design-Expert V 8.0.6軟件進行響應面數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果和數據分析

2.1.1 料液比對杏仁皮單寧得率的影響 由圖1可知,隨著料液比的降低,杏仁皮單寧的得率顯著(P<0.05)增加,當料液比到達1∶20 (g/mL)之后,得率還有微小的增加趨勢,到1∶25 (g/mL)時已趨于穩定。這是由于溶劑用量的增加有利于單寧的提取,但達到一定比例后,大部分單寧已經被溶出,繼續增加溶劑時,單寧得率增加不再明顯,而且會造成溶劑的浪費。

圖1 料液比對杏仁皮單寧得率的影響Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of tannins

從成本與得率方面考慮,選擇料液比范圍為1∶18～1∶24 (g/mL)為宜。

2.1.2 提取時間對杏仁皮單寧得率的影響 由圖2可知,提取時間在30～90 min之內單寧得率隨時間的延長而增加,當提取時間為90 min時單寧得率達到最大值1.62%,而提取時間繼續增加時單寧得率有所降低。原因可能是單寧屬于多酚類化合物,其結構不太穩定,隨著提取時間的延長部分單寧變性導致[17-18]。綜合考慮,后續提取時間控制在70～110 min較為合適。

圖2 提取時間對杏仁皮單寧得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of tannins

2.1.3 提取溫度對杏仁皮單寧得率的影響 由圖3可知,提取溫度在40～70 ℃時,單寧得率隨溫度的升高而增加,70 ℃時單寧得率達到最高值為1.83%,這可能是由于分子運動速度隨溫度的升高而加快,植物中氫鍵也隨之斷裂。當溫度達到80 ℃時,單寧的熱不穩定性使單寧得率降低[17]。因此,提取溫度控制在60～80 ℃為宜。

圖3 提取溫度對杏仁皮單寧得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of tannins

2.1.4 乙醇體積分數對杏仁皮單寧得率的影響 由圖4可知,乙醇的體積分數對單寧得率影響較大。當乙醇體積分數在30%～50%時,單寧得率由1.32%增加到2.11%;在乙醇的體積分數為50%時,達到最高值;當乙醇體積分數在50%～70%時單寧得率不斷下降。這可能是極性過大時,乙醇用量較低,則無法斷裂單寧與多糖、蛋白質間的氫鍵;極性過小時,無法充分溶解單寧類成分[19]。綜合考慮,乙醇體積分數選擇45%～65%比較合適。

圖4 乙醇體積分數對杏仁皮單寧得率的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the yield of tannins

2.2 響應面實驗結果和數據分析

2.2.1 Box-Behnken實驗設計及分析 在單因素基礎上,以料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、乙醇體積分數(D)為考察因素,單寧得率(Y)為指標,利用Design-Expert V 8.0.6軟件設計四因素三水平的響應面實驗,結果見表2。對表2的實驗結果進行線性擬合,得到回歸方程:

Y=2.11+0.025A-4.167E-003B-0.011C-0.027D+0.010AB+0.015AD+0.015BC+2.500E-003BD-0.028CD-0.070A2-0.084B2-0.18C2-0.17D2

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Response surface methodology design and results

表3 模型及方差分析結果Table 3 Results of model and variance analysis

響應面圖可以用來分析多個因素對響應值的影響程度和兩因素之間的交互作用。響應面的陡峭程度直觀的反映了兩因素的交互作用對響應值的敏感程度[20]。由圖5知,乙醇體積分數和提取溫度的交互作用下,曲面較陡,表明其交互作用顯著,這與方差分析相一致。并且,預測最高值均在曲面中心區域內,表明該模型擬合度較好,可預測最佳實驗結果[21]。

2.2.2 驗證實驗 利用Design-Expert V 8.0.6軟件預測得到的杏仁皮單寧最佳提取工藝是料液比為1∶21.51 (g/mL)、提取時間為89.43 min、提取溫度為69.73 ℃、乙醇體積分數為49.65%,單寧得率為2.12%。為了方便進行實驗,調整最佳參數料液比為1∶22 (g/mL)、提取時間為89 min、提取溫度為70 ℃、乙醇體積分數為50%。此實驗平行三次,得出杏仁皮單寧得率為2.13%,與預測值接近。

圖5 乙醇體積分數和提取溫度交互作用對單寧得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots of the effects ofthe interaction between extraction temperatureand ethanol volume fraction on tannins extraction rate

2.2.3 DPPH自由基清除率測定結果 DPPH法是測試抗氧化活性常用的一種方法,其DPPH是一種穩定的自由基,在醇溶液中呈深紫色,它能夠接受電子或氫自由基,成為穩定的抗磁性分子而褪色。因此,清除DPPH自由基的能力可以用來表示物質抗氧化活性的強弱[22]。如圖6所示,在濃度小于250 μg/mL時,單寧的自由基清除率隨濃度的增加呈上升趨勢,其對DPPH自由基的清除作用低于VC陽性對照;當濃度達到250 μg/mL后,杏仁皮單寧對自由基的清除率趨于穩定,與VC相當,單寧的自由基清除率達到了98.65%,證明其具有較強的自由基清除作用。這可能與單寧的分子結構有關,它們能提供氫,與DPPH自由基發生反應生成穩定的DPPH-H,從而使溶液褪色[23-24]。

圖6 VC及杏仁皮單寧對DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical-scavenging activity ofVC and almond skin tannins

3 結論

本研究在單因素的基礎之上,采用Box-Behnken響應面實驗設計,對杏仁皮單寧得率的提取條件進行優化,建立了可靠的杏仁皮單寧提取的回歸模型。得出杏仁皮單寧提取工藝的最佳條件是:料液比為1∶22 (g/mL)、提取時間為89 min、提取溫度為70 ℃、乙醇體積分數為50%,進行三次驗證實驗得到單寧得率為2.13%,與模型預測值基本一致。對最佳工藝下提取的杏仁皮單寧進行抗氧化活性測試,發現其濃度為250 μg/mL時DPPH自由基的清除率達到了98.65%,證明杏仁皮單寧具有較強的抗氧化活性。本實驗首次在食品企業的廢棄物杏仁皮中提取得到單寧,建立可靠的工藝路線,并初步對其抗氧化活性進行評價,為后續有效開發利用杏仁皮單寧廢棄資源提供基礎。