華中枸骨葉總黃酮的純化及其抑菌活性研究

(湖北民族大學醫學部,湖北恩施 44500)

華中枸骨(IlexcentrochinensisS. Y. Hu),為冬青科冬青屬植物,又名針齒冬青、小果冬青,主要生長在山坡上或灌木叢中。在湖北、安徽、四川、貴州、湖南等地均有分布[1]。其藥用部位為根和葉,性味甘涼,具有清熱解毒功效,恩施民間其葉常被用來治療燙火燒傷[2]。在我國有些地區常用其葉來制作苦丁茶[3]。研究發現,華中枸骨葉中含有大量黃酮類成分,如柚皮素、橙皮素、洋芹素[4]、槲皮素、山奈酚[5]等,有極大的開發價值。目前黃酮類化合物的提取以溶劑法為主,提取液中雜質含量較多[6],為提高總黃酮質量分數,為后期研究華中枸骨葉總黃酮的生物學活性提供基礎,需要對華中枸骨葉總黃酮粗提物進一步分離純化。

近年來已有關于冬青科冬青屬植物中黃酮成分分離純化的研究報道,曾海波[7]采用硅膠層析柱對枸骨根中的黃酮成分進行了分離純化,但其目的是為了得到單個化合物,并不適合用于以保留提取物中黃酮類成分為目的的分離純化。劉志祥等[8]采用AB-8大孔吸附樹脂對枸骨葉中的總黃酮進行純化,賈夏等[9]采用D-101大孔吸附樹脂對大葉冬青葉中的黃酮類化合物進行吸附。這兩者采用的均為靜態法,靜態法雖然較動態法簡單,可控性強,但其不能反映真實的操作情況。目前尚未發現用大孔吸附樹脂純化華中枸骨葉總黃酮的研究。華中枸骨葉中黃酮類成分以弱極性為主,D101大孔樹脂的適用范圍較廣,對非極性或弱極性的黃酮類化合物均有較強的吸附解吸能力[10-11],因此本實驗采用了D101大孔吸附樹脂,并研究其對華中枸骨葉總黃酮的動態吸附和解吸性能,同時對純化前后總黃酮的抗菌作用進行研究,旨在為土家藥材華中枸骨在抗菌作用方面的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

華中枸骨葉 采自湖北省恩施土家族苗族自治州建始縣,經湖北民族大學醫學部中藥教研室朱敏英副教授鑒定為華中枸骨的葉;蘆丁標準品(UV≥98%) 上海金穗生物科技有限公司;D101大孔樹脂 國藥集團化學試劑有限公司;MH瓊脂 杭州微生物試劑有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇 均為國產分析純,;金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、宋內志賀菌(CMCC51592) 湖北民族大學醫學部實驗室。

UV-2700紫外-可見分光光度計 日本津島企業管理有限公司;BT223S分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司;PHS-3C酸度計 上海碩光電子科技有限公司;GSP-910MBE恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司;NU-425-400S生物安全柜 美國NuAire公司;CL-32L高壓蒸汽滅菌器 日本ALP公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮粗提物的制備 取華中枸骨葉粗粉適量,在25 ℃,超聲功率480 W條件下,按液料比25∶1 (mL/g)加入體積分數為55%乙醇,超聲提取30 min,提取2次,合并2次濾液,離心、濃縮,用水定容,得到粗提物。

1.2.2 總黃酮的測定 參考2015版《中國藥典》繪制標準曲線[12]。選用蘆丁作為對照品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH光度法,以蘆丁質量濃度Y(mg/mL)為橫坐標,以吸光度X為縱坐標,得到回歸方程Y=8.3286X+0.0148,R=0.9995,在0.008～0.048 mg/mL范圍內,線性關系良好。根據標準曲線方程計算總黃酮含量。

總黃酮質量(mg)=總黃酮含量(mg/mL)×體積(mL)

式(1)

1.2.3 大孔樹脂的預處理參考文獻[13]的方法處理大孔樹脂。D101大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h后,以濕法裝柱,繼續用95%乙醇溶液持續沖洗,至流出液與水1∶1混合后無白色渾濁為止,最后用大量水沖洗至無醇味即可。

1.2.4 大孔吸附樹脂動態吸附和解吸試驗

1.2.4.1 泄漏曲線考察 參考文獻[14]的方法考察泄漏曲線。將預處理好的大孔樹脂濕法裝入玻璃柱(柱長200 mm,內徑10 mm),使樹脂柱徑高比1∶9.5,取粗提液(總黃酮質量濃度0.525 mg/mL,pH4.93)14 BV上樣,上樣流速6 BV/h,分段收集流出液,測定每份中總黃酮量,即為總黃酮泄漏量。以流出液體積為橫坐標,總黃酮泄漏量為縱坐標繪圖。

1.2.4.2 上樣液質量濃度 將預處理好的D101樹脂以濕法裝柱,使其樹脂柱徑高比為1∶9.5,取上樣液3 BV(pH4.93),總黃酮質量濃度分別為0.315、0.525、0.735、0.945、1.155 mg/mL,上樣速度6 BV/h,上樣完畢后,靜置30 min。洗脫時,先用3 BV去離子水洗脫,再用70%乙醇9 BV洗脫,洗脫流速6 BV/h,收集流出液、水洗液和洗脫液,測定總黃酮含量,根據公式(2)和(3)分別計算吸附率、回收率。

吸附率(%)=[上樣液總黃酮質量-(流出液總黃酮質量+水洗液總黃酮質量)]/上樣液總黃酮質量×100

式(2)

式(3)

1.2.4.3 徑高比 將預處理好的D101大孔吸附樹脂以濕法裝柱,使其樹脂柱徑高比為1∶6.5、1∶7.5、1∶8.5、1∶9.5、1∶11.5,分別取上樣液3 BV(總黃酮質量濃度0.525 mg/mL、PH4.93),上樣速度6 BV/h,上樣完畢后,靜置30 min。洗脫條件同上。收集流出液、水洗液和洗脫液,測定總黃酮含量,分別計算吸附率、回收率。

1.2.4.4 pH 將預處理的D101大孔吸附樹脂以濕法裝柱,使其樹脂柱徑高比為1∶7.5,取上樣液3 BV(總黃酮濃度0.525 mg/mL,pH分別為1.93、2.93、3.93、4.93、5.93),上樣速度6 BV/h,上樣完畢后,靜置30 min。洗脫條件同上。收集流出液、水洗液和洗脫液,測定總黃酮含量,計算吸附率、回收率。

1.2.4.5 洗脫劑乙醇體積分數 將預處理好的D101大孔吸附樹脂以濕法裝柱,使其樹脂柱徑高比為1∶7.5,取華中枸骨葉粗提液(總黃酮質量濃度為 0.525 mg/mL,pH2.93)3 BV,上樣速度6 BV/h,上樣完畢后,靜置30 min。洗脫時,先用3 BV去離子水洗脫后,再分別用50、60、70、80、90%乙醇(9 BV)洗脫,洗脫流速6 BV/h,收集流出液、水洗液和洗脫液,測定總黃酮含量,根據公式(2)和(4)分別計算解吸率、回收率。

解吸率(%)=洗脫液總黃酮質量/[上樣液總黃酮質量-(流出液總黃酮質量+水洗液總黃酮質量)]×100

式(4)

1.2.4.6 洗脫乙醇用量的考察 將預處理好的D101大孔吸附樹脂以濕法裝柱,使其樹脂柱徑高比為1∶7.5,取華中枸骨葉粗提液(總黃酮質量濃度0.525 mg/mL,pH2.93)3 BV,上樣速度6 BV/h,上樣完畢后,靜置30 min。洗脫時,先用3 BV去離子水洗脫后,再用70%乙醇15 BV洗脫,分段收集洗脫液,測定總黃酮含量,計算總黃酮質量。

1.2.4.7 正交試驗和驗證試驗 以總黃酮回收率為考察指標,考察上樣液總黃酮質量濃度(A)、徑高比(B)、pH(C)以及乙醇體積分數(D)對總黃酮回收率的影響,采用L9(34)正交表安排實驗。在得到的優化工藝條件下,富集純化華中枸骨葉總黃酮。重復3次,結果取平均值。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.2.5 總黃酮的抑菌試驗 分別取純化前后總黃酮提取物適量,配制成總黃酮質量濃度為50 mg/mL溶液,經0.22 μm濾菌器過濾除菌后備用。采用牛津杯法測定抑菌活性[15]。在直徑90 mmMH瓊脂平板上加入0.1 mL菌液(菌液濃度為107cfu/mL),涂布均勻后,放置4個牛津杯,每個牛津杯中加入藥液200 μL(其中1個牛津杯中加入無菌水作陰性對照,1個牛津杯中加入慶大霉素作為陽性對照),置于37 ℃培養箱中培養18 h后觀察結果。重復3次,結果取平均值。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂動態吸附和解吸試驗

2.1.1 泄漏曲線 由圖1可知,隨著流出液的增加,總黃酮泄漏量逐漸增多。當流出液體積為3 BV時,達到泄漏點(流出液中總黃酮的濃度是上樣液濃度的1/10),以此為吸附終點[16-17],故上樣量體積選擇為3 BV。

圖1 泄漏曲線Fig.1 Breakthrough curve

2.1.2 上樣液質量濃度 由圖2可知,隨著上樣液質量濃度的增加,總黃酮吸附率和回收率先增加后減少,在質量濃度為0.525 mg/mL時達到最大。當濃度低于0.525 mg/mL時,大孔吸附樹脂還有較多的吸附黃酮的位點,因此吸附率會隨著濃度的增加而增大;但隨著濃度的進一步增加,溶液中的雜質含量也會越來越多,與華中枸骨葉黃酮類成分競爭吸附樹脂的位點的作用也會越來越強[18],因此吸附率和回收率會均下降。故上樣液質量濃度選擇為0.525 mg/mL。

圖2 上樣液質量濃度對總黃酮回收率和吸附率的影響Fig.2 Effect of sample concentrationon the recovery and adsorption rate of total flavonoids

2.1.3 徑高比 由圖3可知,隨著徑高比的增加,吸附率逐漸增強,在徑高比為1∶11.5時,吸附率最大;但在徑高比為1∶7.5時,總黃酮回收率最高。為了節約成本,提高柱效,本試驗選擇徑高比為1∶7.5。

圖3 徑高比對總黃酮回收率和吸附率的影響Fig.3 Effect of diameter height rateon the recovery and adsorption rate of total flavonoids

2.1.4 pH 由圖4可知,在pH1.93和2.93時其吸附率均為100%;在pH為2.93時,黃酮回收率最高。但隨著pH的進一步增加,其吸附率和回收率都下降。可能是當pH較小時,華中枸骨葉中的黃酮類成分呈現為分子狀態,利于吸附;但當pH較高時,黃酮類化合物中酚羥基上的氫會解離,變為離子結構,不利于吸附[19]。綜合吸附率和回收率結果,最佳pH確定為2.93。

圖4 pH對總黃酮回收率和吸附率的影響Fig.4 Effect of sample PH on the recoveryand adsorption rate of total flavonoids

2.1.5 洗脫劑乙醇體積分數 由圖5可知,隨著洗脫劑乙醇體積分數的增加,黃酮的解吸率、回收率逐漸增加,在用70%乙醇洗脫時,解吸率、回收率達到最大。根據相似相溶的原理,70%乙醇的極性應該是溶解華中枸骨葉總黃酮的最佳極性,因此最佳乙醇體積分數為70%。

圖5 乙醇體積分數對總黃酮回收率和解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the recoveryand desorption rate of total flavonoids

2.1.6 洗脫乙醇用量的考察 由圖6可知,大部分黃酮在前3 BV洗脫液中已被洗脫下來,在第8 BV的洗脫液中黃酮的含量已很少,在第9 BV洗脫液中,黃酮含量為0,因此判定大孔樹脂上吸附的黃酮已全部洗脫在前8 BV乙醇中,所以選擇洗脫劑體積為8 BV較為合適。

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

圖6 乙醇洗脫用量對總黃酮回收率的影響Fig.6 Effect of ethanol volume on therecovery rate of total flavonoids

2.1.7 正交試驗和驗證試驗 由表2、表3可知,在影響華中枸骨葉粗提液總黃酮回收率的4個因素中,其影響的大小順序為C>B>A>D,并且四個因素中各水平之間的差異都極顯著(P<0.01)。從極差和方差分析結果可知,華中枸骨葉總黃酮的分離純化工藝的最佳條件為A3B3C1D2,即上樣液質量濃度為0.735 mg/mL、徑高比為1∶8.5、PH為1.93、洗脫劑乙醇體積分數為70%。在此工藝條件下分離純化總黃酮,總黃酮回收率平均為91.06%,其質量分數為78.26%,較純化前的質量分數48.52%有所提高,說明此工藝條件對華中枸骨葉中總黃酮起到了一定的富集純化作用。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 總黃酮的抑菌試驗結果

由表4結果可知,華中枸骨葉總黃酮粗提物純化前后對4種細菌均有抑菌作用,除大腸埃希菌外,對于其他3種菌的抑菌效果均是粗提物好于純化物。

3 結論

本試驗以華中枸骨葉中總黃酮的吸附率、解吸率、回收率為考察指標,在單因素實驗基礎上,采用正交設計優化D101大孔樹脂純化總黃酮的工藝條件。在優化工藝條件下得到總黃酮回收率為91.06%,總黃酮質量分數為78.26%,較純化前的質量分數48.52%有所提高。本方法操作簡單,分離純化效果較好,可以用于華中枸骨葉中總黃酮的富集純化。

表4 總黃酮純化前后的抑菌作用Table 4 Antibacterial activity of total crude and purified flavonoids

隨著抗生素的廣泛應用甚至濫用,臨床上耐藥菌株越來越多,從傳統中藥中開發具有抗菌作用的成分已成為解決細菌耐藥性的一個新途徑[20]。體外抗菌結果顯示,在總黃酮質量濃度為50 mg/mL時,純化前后的華中枸骨葉總黃酮對常見菌均有抗菌作用,除大腸埃希菌外,純化后的華中枸骨葉總黃酮對其他三種菌的抑菌效果要弱于粗提液,分析其原因,可能與下列因素有關:華中枸骨葉中具有抗菌活性的成分很多,其抗菌機制也很復雜,很多成分是聯合在一起發揮抗菌作用,本工藝研究是以富集純化總黃酮為主,在富集純化的過程中,其他有效的抗菌成分可能會丟失。在后續的研究中,將對華中枸骨葉中的抗菌成分進一步的分離純化,為華中枸骨葉這一土家藥材在抗菌作用方面的應用提供基礎。