皂莢多糖超聲波提取工藝優化及體外抗氧化活性研究

高 潔,董文賓2,3,王 勇4,*,張泉榮,張文秀

(1.陜西國際商貿學院醫藥學院,陜西西安 710000;2.陜西科技大學,陜西西安 710000;3.陜西省食品加工工程技術研究中心,陜西西安 710000;4.陜西農產品加工技術研究院,陜西西安 710000)

皂莢(GleditsiasinensisLam.)系豆科蘇木亞科(或云實亞科)的多年生木本植物[1],我國河北、河南、陜西種植面積較廣[2-3]。皂莢不僅具有抗菌、殺蟲、殺鼠、抗病毒、抑制腫瘤細胞增殖等活性[4-5],同時還具有免疫調節、抗凝血、抗炎等活性[6]。

皂莢的主要化學成分包含萜類化合物、黃酮類化合物、酚酸類化合物、甾體類化合物和多糖[7]。植物多糖具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、降血糖等生物學活性[8-9],研究前景較大。多糖提取方法種類較多,不同的提取方法對多糖活性影響較大,超聲波提取法速度快,時間少、效果明顯[10],且不受高溫的影響。

當前,對于皂莢的研究報道主要集中在皂莢刺活性成分、皂莢素[11],而對皂莢多糖的提取和生物活性研究較為少見,已報道的皂莢多糖提取工藝也以回流法提取為主[12],皂莢多糖的超聲波法提取和體外抗氧化性的研究未見報道。本研究將皂莢多糖作為主要研究對象,優化其超聲波法提取工藝參數,并對該法所提取的皂莢多糖開展體外抗氧化活性研究,旨在為皂莢資源能夠更有效的利用在醫藥保健領域提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皂莢 采摘于陜西省眉縣太白山,經陜西中醫藥大學雷國蓮教授鑒定為皂莢Gleditsiajaponic.miq;VC分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基基肼(DPPH) 色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;所有分離及活性測定用有機溶劑均為分析純。

粉碎機FW100 天津市泰斯特儀器有限公司;SJIA-650W超聲處理器 寧波市雙嘉儀器有限公司;YP20002電子天平 上海越平科學儀器有限公司;SHZ-D(III)循環水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司;KDC-40低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;DZF-6020型恒溫鼓風干燥箱 上海赫田科學儀器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 皂莢預處理 稱取一定量的皂莢,凈制后干燥,粉碎并過40目篩,置于50 ℃恒溫干燥箱中干燥后,備用。

1.2.2 皂莢多糖提取 稱取皂莢粉末,按比例加入水超聲提取3次,取出料液,進行離心(3000 r/min,15 min),收集濾液,濃縮,加3倍無水乙醇沉淀,脫水干燥,利用sevag法除蛋白,冷凍干燥,得皂莢多糖樣品。

1.2.3 皂莢多糖含量測定 采用硫酸-苯酚法[13]進行皂莢多糖含量測定,根據線性回歸方程計算皂莢多糖得率:

式(1)

式中:R:皂莢多糖含量,%;C:多糖濃度,g/mL;V:多糖溶液體積,mL;M:皂莢干粉質量,g。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 超聲提取溫度對皂莢多糖得率的影響 固定液料比40∶1 (mL/g),超聲提取溫度50 ℃,超聲時間30 min,超聲功率250 W,考察不同超聲提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對得率的影響。

1.2.4.2 液固比對皂莢多糖得率的影響 固定超聲溫度50 ℃,超聲時間30 min,超聲功率250 W,考察不同液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 (mL/g))對得率的影響。

1.2.4.3 超聲時間對皂莢多糖得率的影響 固定液固比40∶1 (mL/g),超聲溫度50 ℃,超聲功率250 W,考察不同超聲時間(10、30、50、70、90 min)對得率的影響。

1.2.4.4 超聲功率對皂莢多糖得率的影響 固定液固比40∶1 (mL/g),超聲溫度50 ℃,超聲時間30 min,考察不同超聲功率(50、150、250、350、450 W)對得率的影響。

1.2.5 響應面試驗 以皂莢多糖得率為響應值,根據單因素實驗結果選定水平范圍,采用四因素三水平響應面設計,進行數據分析,模型確立,從而確定超聲波提取皂莢多糖的最優提取工藝條件。

1.2.6 皂莢多糖體外抗氧化活性試驗

式(2)

式中:R:O-2·清除率,%;A0:空白對照液的吸光度;Ai:加入皂莢多糖溶液的吸光度。

1.2.6.2 DPPH·清除能力的測定 將等體積皂莢多糖溶液及DPPH·溶液(0.2 mmol/L)混勻后避光靜置反應30 min,以無水乙醇為參照,在517 nm波長處測定其吸光度Ai。同時,測得樣品溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Aj,并測得DPPH·溶液(0.2 mmol/L)與等體積無水乙醇混合液的吸光度Ac,以VC為陽性對照[16],則皂莢多糖對DPPH·的清除率計算公式如下:

式(3)

式中:R:DPPH·清除率,%;A0:DPPH·與無水乙醇混合液的吸光度;Ai:DPPH·與樣品反應后的吸光度;Aj:不加鄰苯三酚的皂莢多糖與無水乙醇溶液的吸光度

1.2.6.3 ·OH清除能力的測定 取10 mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液、10 mmol/L FeSO4溶液、待測樣品各1 mL,混勻后于37 ℃恒溫水浴反應30 min。加入1mL 0.03% H2O2溶液,反應結束后于510 nm處測定樣品吸光值[17-19]?？瞻捉M用H2O代替樣品,其余同樣品組。以H2O作空白對照,VC作陽性對照。按下式計算清除率。

式(4)

式中:R:·OH清除率,%;A0:空白對照的吸光度;Ai:·OH與皂莢多糖反應后的吸光度;Aj:不加 H2O2的皂莢多糖與無水乙醇溶液的吸光度。

1.3 數據處理

基于皂莢多糖提取的單因素試驗基礎,選定影響多糖得率的4個因素:提取溫度(X1)、液固比(X2)、提取時間(X3)、超聲功率(X4),進行水平設定,進行Box-Behnken試驗設計,得到29個試驗點的設計方案,方案設計及結果如表1所示:

表1 中心組合實驗Box-Behnken設計因素和水平編碼值Table 1 Experimental levels employed for Box-Behnken design

注:采用Design-Expert 8.0.6軟件進行數據分析、統計及作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溫度對得率的影響 如圖1所示,皂莢多糖得率在超聲提取初期,隨著溫度的增加而增加,在超聲提取過程中,高溫有助于加劇分子擴散運動,加速溶液原料間的相互作用,使細胞結構能更好的被破壞,多糖能夠更有效的溶出,得率最大可達19.23%,但是當提取溫度高于50 ℃時,隨后得率不再上升,反呈現出平穩下降的趨勢,溫度過高可使部分糖鏈發生斷裂,并且影響其生物活性,同時會難以控制提取條件。因此,將提取溫度50 ℃選為單因素最佳溫度。

圖1 提取溫度對皂莢多糖得率的影響Fig.1 Effect of the extraction temperature on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.1.2 液固比對皂莢多糖得率的影響 圖2反映了不同的液固比提取對皂莢多糖得率的影響,由結果可知,隨著液固比的增加多糖得率有了呈明顯的上升趨勢,當液固比為40∶1 (mL/g)時,多糖得率最大可達19.02%,持續增大液固比后,多糖得率較為穩定。液固比的增加與助于原料的浸提,從而加速多糖的溶出,但溶劑量持續加大可使固液兩相混合不徹底,傳質不均勻,從而造成得率下降。因此,將液固比40∶1 (mL/g)選為單因素最佳液固比。

圖2 液固比對皂莢多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid/material rate on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.1.3 提取時間對得率的影響 由圖3可知,當提取時間為30 min時,皂莢多糖得率最大可達19.18%,提取時間高于30 min后,皂莢多糖的得率反而隨著時間的增加呈現出下降趨勢。這表明,超聲時間在一定范圍能是可加速多糖的溶出速度,但超聲時間過長可使超聲空化作用增強,機械力增大,溫度上升,從而將已溶出的多糖結構發生破壞。因此,將提取時間30 min選為單因素最佳提取時間。

圖3 提取時間對皂莢多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.1.3 超聲功率對得率的影響 如圖4所示,當超聲功率為250 W時,皂莢多糖提取最大,當超聲功率高于250 W時,得率有明顯下降趨勢。這表明,超聲功率的增大有助于液固兩相的相互混合和細胞結構的破碎,從而使得率增大,但功率過強,聲波作用加大,機械力增強,將對多糖結構進行破壞,從而降低多糖的得率[20],同時也造成了資源的浪費,因此,將超聲功率250 W選為單因素最佳提取功率。

圖4 超聲功率對皂莢多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.2 響應曲面法優化皂莢多糖提取工藝優化

2.2.1 回歸模型建立與方差分析 使用Design Expert 8.0.6進行的多次數據回歸分析,皂莢多糖得率與溫度(X1),液固比(X2),時間(X3)和超聲功率(X4)的多元二次回歸方程:

表2 優化實驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design and observed responses

表3 回歸方程中各項的方差分析Table 3 Analysis result of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

圖5 因素交互作用對皂莢多糖得率的響應面結果Fig.5 Response surface model plots for the interaction effects on the extration rate of polysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.2.2 交互作用分析 圖5為各因素交互作用對皂莢多糖得率的響應面和等高線圖。由圖5(a)可知,隨著提取溫度和提取時間的增大,皂莢多糖得率呈現出先增高后緩慢降低的趨勢,等高線呈現橢圓形,表明提取時間與提取溫度兩因素交互作用影響顯著;由圖5(b)表明,隨著提取溫度和超聲功率的增大,皂莢多糖得率呈現出先上升后緩慢下降的趨勢,等高線呈現橢圓形,且曲面較為陡峭,表明提取時間與超聲功率兩因素交互作用顯著;圖5(c)表明,皂莢多糖得率隨著提取時間與液固比的增大而呈現出先增大而后平緩下降的趨勢,由等高線圖和響應面圖可看出二者交互作用明顯;圖5(d)表明,隨著超聲功率與液固比的增大,得率呈現出先增后降的趨勢,曲面圖陡峭,因此二者交互作用具有一定的顯著性。

2.2.3 超聲波提取最佳工藝參數驗證 經軟件分析,可得出該模型的最佳工藝條件為:溫度51.46 ℃,液固比36.89∶1 (mL/g),時間30.39 min,功率286.30 W,在此條件下皂莢多糖得率可達31.34%。為操作方便可將提取條件調整為:溫度50 ℃,液固比35∶1 (mL/g),時間30 min,功率285 W,超聲提取3次,在調整工藝條件下,平行做三次驗證實驗,得率為30.65%±0.25%,結果和預測值誤差較小,表明調整后的超聲波提取工藝參數可用。

2.3 皂莢多糖體外抗氧化活性試驗

圖6 皂莢多糖對超氧陰離子的清除作用Fig.6 Superoxide anion radical scavenging capacity ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.3.2 清除DPPH·能力的測定 由圖7可知,皂莢多糖對DPPH·的清除能力隨著皂莢多糖濃度的增大而增大,在現有濃度組別試驗中,當多糖濃度達到4 mg/mL時,清除率達到最大值40.2%,IC50值為6.9 mg/mL;陽性對照VC濃度為4 mg/mL時,清除率達到最大值95%。

圖7 皂莢多糖對DPPH·的清除作用Fig.7 DPPH radical scavenging capacity ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.3.3 清除羥自由基(·OH)能力 由圖8可知,在現有濃度組別試驗中,當皂莢多糖濃度為3.5 mg/mL時,皂莢多糖對羥基自由基的清除率達到最大值81.6%,IC50值為1.5 mg/mL;當陽性對照VC濃度為4 mg/mL時,VC對羥自由基的清除率達到94%,且其IC50值為0.556 mg/mL。試驗結果表明,皂莢多糖清除請自由基的能力隨著多糖溶液濃度的升高而升高,具有較強的羥自由基清除能力。

圖8 皂莢多糖對羥自由基的清除作用Fig.8 Hydroxyl radical scavenging capacity ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

3 結論

本研究選用超聲波法對皂莢多糖進行提取,在單因素實驗基礎上,進行響應面設計法進行參數優化,并對所提取的皂莢多糖進行體外抗氧化能力測定。超聲波法優化最佳工藝參數為:溫度50 ℃,液料比35∶1 (mL/g),時間30 min,功率285 W,在此條件下提取3次,得率為30.65%±0.25%。體外抗氧化研究表明,皂莢多糖對于羥自由基,DPPH自由基,超氧陰離子均具一定的清除能力,其中對羥自由基的清除力最強,清除超氧陰離子能力最弱,且其抗氧化能力與多糖濃度呈現出一定的量效關系。

皂莢多糖的得率及生物活性受品種、產地、提取方法等因素的影響較大,本研究在進行抗氧化試驗時僅進行了體外的自由基清除試驗,但并未對皂莢多糖在體內抗氧化能力進行測定,也未對不同方法提取的多糖抗氧化能力進行對比,后續研究將在抗氧化能力影響因素及體內抗氧化能力測定方面將開展進一步研究工作。