納米硒合成細菌Lxz-41的鑒定、培養條件優化及其在富硒獼猴桃栽培中的應用

(陜西省微生物研究所,陜西西安 710043)

硒是生態系統中非常重要的營養元素,有著“生命元素”之稱。1957年,Schwarz確定硒是人和動物必需的營養元素。1973年,硒被世界衛生組織認定是人體必需的微量元素,此后大量的研究表明,硒的營養和毒性劑量范圍較窄,人體食物中硒含量少于0.05 mg/kg就會造成缺硒,大于5 mg/kg又會產生中毒[1]。硒在地球上分布不均勻,中國72%地區處于缺硒、低硒帶,膳食中硒攝入量的不足嚴重影響著幾億人口的身體健康[2]。缺硒會引起人類的克山病、大骨節病、癌癥、糖尿病、心腦血管病、不育癥等疾病,而適當地補硒可以防癌、抗腫瘤和抗衰老[3-5]。近年來,隨著人們越來越注重保健和養生,各種富硒產品應運而生,種植戶為提高賣點,在種植過程中都噴灑無機硒(硒酸鈉、亞硒酸鈉)來提高產品中硒的含量。但是無機硒(硒酸鈉、亞硒酸鈉)毒性大,被常用危險化學品的分類及標志GB13690-2009列為第六類劇毒物質,無機硒的使用嚴重危害了環境和人類健康。

生物納米硒是由微生物產生的,尺寸在納米級別的單質硒形態[6],具有更寬的安全劑量范圍,有望成為無機硒的替代品。根據急性毒性(LD50)數據顯示[7],無機硒LD50=15 mg/kg,有機硒LD50=30～40 mg/kg,納米硒LD50=113 mg/kg。迄今,納米硒是已發現毒性最低的硒形態[8]。納米硒的產生與細菌的氧化還原反應密切相關[9],隨著研究的不斷深入,能夠合成納米硒的微生物涵蓋的種屬極其豐富,超過30個屬,包括大腸桿菌(Escherichiacoli)[10]、庫德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)[11]、乳酸桿菌(Lactobacillus)[12]等,但相關硒轉化芽孢桿菌的研究相對較少。另外,芽孢桿菌在土壤中的抗逆性存活能力強,繁殖快,適合于后期制備納米硒菌肥在土壤中施用。本實驗以從陜西省紫陽縣富硒土壤中篩選到的一株納米硒轉化芽孢桿菌為材料,對其進行了鑒定和納米硒轉化條件的優化,并初步應用在富硒獼猴桃的栽培中,以期為后期微生物納米硒肥的應用提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Lxz-41 2016年分離自陜西省安康市紫陽縣富硒土,菌株已保存至中國典型培養物保藏中心(CCTCC),編號M2016578;酵母粉、酵母膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限公司;尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、正辛醇、無水乙醇 天津市天力化學試劑有限公司;葡萄糖、蔗糖 天津市科密歐化學試劑有限公司;亞硒酸鈉 國藥集團;IF-A增菌液 美國Biolog公司;Ezup DNA提取試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;其它試劑 均為國產分析純;斜面活化培養基 LB培養基;硒固體平板培養基 葡萄糖2%,酵母粉0.5%,氯化鈉0.5%,亞硒酸鈉0.1%,瓊脂粉1.5%,pH自然;液體種子培養基 葡萄糖2%,酵母粉0.5%,氯化鈉0.5%,pH自然;液體基礎培養基 葡萄糖2%,酵母粉0.5%,磷酸氫二鉀0.3%,磷酸二氫鉀0.1%,氯化鈉0.5%,亞硒酸鈉0.15%,pH自然。

DHZ-D恒溫搖床 蘇州培英實驗設備有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;96Ⅱ超聲細胞破碎儀 西安比朗生物科技有限公司;722可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;6700F掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社;2760 PCR儀 美國應用生物系統公司(ABI);XRS凝膠成像系統 美國伯樂公司(Bio-Rad);Biolog自動微生物鑒定儀 美國Biolog公司;MK3酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化與形態觀察 將保藏的lxz-41菌株接入斜面,30 ℃靜置活化24 h后,將活化好的斜面在硒固體平板培養基上進行劃線,通過觀察菌落是否變紅來檢驗菌株lxz-41是否具有亞硒酸鈉轉化能力[13]。刮取斜面活化菌落,進行2.5%戊二醛固定4 h,磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次,乙醇梯度脫水(分別為30%、50%、70%、85%、90%乙醇各1次,100%乙醇2次,15 min/次),乙酸異戊酯置換乙醇2次(20 min/次),每一步完成后經8000 r/min離心5 min。將樣品分別在-20、-40和-80 ℃冷凍12 h,并進行-70 ℃真空冷凍干燥24 h后,掃描電鏡觀察菌體形態[14]。

1.2.2 lxz-41菌株的鑒定 取斜面菌落稀釋至Biolog增菌液IF-A中,控制濁度達到90%～98%之間,然后加入到GenIII96孔板中,30 ℃靜置恒溫培養24 h,進行Biolog生理生化的鑒定。同時,取斜面菌落,采用細菌DNA提取試劑盒進行lxz-41菌種總DNA的提取,利用通用引物進行16S rDNA的擴增,PCR程序為94 ℃預變性4 min,94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30個循環,72 ℃修復延伸10 min,4 ℃ 冷卻。PCR產物在上海生工生物工程有限公司進行一代測序,然后將序列進行NCBI數據庫的比對,利用MAGE 5.0軟件構建進化樹[15]。

1.2.3 lxz-41菌株對亞硒酸鈉的耐受性實驗

1.2.3.1 耐受性的考察 按照1.2.1方法將菌株活化后,接種于液體種子培養基中,30 ℃、180 r/min搖瓶培養12 h,待用。分別配制亞硒酸鈉含量為0、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、5000 mg/L液體培養基,加入到96孔板中,每孔加150 μL,每個濃度三個平行,同時做三塊96孔板作為重復,然后每孔接入5 μL lxz-41種子液,30 ℃靜置培養18 h后,立即測定600 nm吸光值和亞硒酸鈉的轉化率,同時進行掃描電鏡,考察菌種lxz-41對亞硒酸鈉的耐受情況。

1.2.3.2 亞硒酸鈉轉化率的測定 將方法1.2.3.1中培養18 h后的96孔板的重復孔進行混合,6000 r/min離心10 min取沉淀,加入無菌水,進行超聲破碎(150 W,超聲10 s,間歇5 s,共20次),10000 r/min離心2 min,取沉淀進行60 ℃烘干4 h,按照GB 5009.93-2017中電感耦合等離子體質譜法進行硒含量的測定,并計算納米硒的轉化率。

轉化率(%)=(沉淀中硒總量/初始培養基中硒總量)×100

1.2.4 菌株lxz-41對納米硒的轉化條件優化 將1.2.1中活化好的斜面菌種轉接于液體種子培養基中,30 ℃、180 r/min搖瓶培養12 h,即為種子液,并以1%的接種量接入亞硒酸鈉濃度為1500 mg/L待優化的液體基礎培養基中,在一定的溫度和搖床轉速條件下,以納米硒轉化率為指標,采用單因素和響應面試驗對培養基組分與培養條件進行優化。

1.2.4.1 單因素實驗 碳源種類及濃度的篩選:固定液體基礎培養基中除碳源以外的其它組分不變,調整初始pH為7.0,保持1%接種量,在30 ℃下,150 r/min培養18 h,考察不同碳源種類(蔗糖、葡萄糖、飴糖、可溶性淀粉)對納米硒轉化率的影響,而后在最佳碳源種類下,考察碳源濃度(2%、4%、6%、8%、10%)對納米硒轉化率的影響,從而獲得最佳的碳源種類及濃度。

氮源種類及濃度的篩選:固定液體基礎培養基中除氮源以外的其它組分不變,調整初始pH為7.0,保持1%接種量,在30 ℃下,150 r/min培養18 h,以納米硒轉化率為指標,考察無機氮和有機氮種類(尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、酵母粉、酵母膏、蛋白胨)對轉化納米硒轉化率的影響,且在最佳氮源組合下,分別考察了有機氮濃度(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%)和無機氮源濃度(0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)對納米硒轉化率的影響,從而獲得最佳的氮源種類及濃度。

初始pH的篩選:固定液體基礎培養基的組分不變,調整培養基的初始pH分別為5、6、7、8、9、10,在30 ℃下150 r/min搖床培養18 h,考察不同初始pH對納米硒轉化率的影響。

溫度的篩選:固定液體基礎培養基的組分不變,調整初始pH為7.0,保持1%接種量,在不同培養溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)下150 r/min搖床培養18 h,考察溫度對納米硒轉化率的影響。

轉速的篩選:固定液體基礎培養基的組分不變,調整初始pH為7.0,保持1%接種量,在轉速分別為100、120、140、160、180、200 r/min的搖床中 30 ℃培養18 h,考察不同搖床轉速對納米硒轉化率的影響。

1.2.4.2 響應面試驗 根據單因素實驗的結果,固定最佳的單因子條件,選取對結果影響顯著的因素進行進一步的Box-Behnken試驗,以蔗糖濃度、尿素濃度和培養溫度為變量,納米硒轉換率為響應值,通過響應面進行條件優化,因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 微生物納米硒肥的應用 按照1.2.3制備lxz-41種子培養液,并按照5%的接種量接入最優培養基中,進行10 L發酵罐納米硒的合成發酵,18 h后,6000 r/min離心10 min取沉淀,并加入少量無菌水懸浮,進行超聲破碎(150 W,超聲10 s,間歇5 s,共20次)[16]。為方便后期農戶使用,超聲后的懸液用水稀釋至硒含量為250 mg/L,即為液體微生物納米硒肥。將實驗制備的微生物納米硒肥在周至農家樂果蔬合作社獼猴桃基地進行獼猴桃富硒小區實驗,將液體微生物納米硒肥用水稀釋25倍,分別在獼猴桃開花期(5月)和果實膨大期(7月)進行葉面噴灑,10月進行人工采摘。每次噴施量為1.5 kg/棵或120 kg/畝。小區劃分見表2,每個小區都是5行3列。待果實成熟后取樣。進行果肉、果皮、葉中硒含量的測定。硒含量測定方法同1.2.3.2進行。

表2 陜西周至獼猴桃微生物富硒實驗分區Table 2 Microorganism selenium-enriched experimentarea of kiwi from Zhouzhi,Shaanxi province

注:3×5代表實驗區每組地塊所種的獼猴桃的排列為3行5列,共15棵;CK組為未噴灑納米硒樣品;T1組為噴灑與納米硒相同硒含量的亞硒酸鈉樣品;T2組為噴灑納米硒樣品。

取樣方法:對每個地塊采用蛇形取樣法,共取5個樣,保證每一行取一次樣。另外,為對比硒在果實與枝葉中的分布情況,取樣時要保證每個獼猴桃的果實、枝葉來自同一樣本。每個地塊樣品混合,進行測定。

1.3 數據處理

以上實驗均設置三組重復,結果以平均值±標準偏差的形式表示。單因素實驗采用GraphPad 8.0軟件進行繪圖,采用SAS 9.0軟件進行單因素顯著性分析(P<0.05)。響應面實驗采用Design Expert 8.0進行設計和結果分析.

2 結果與分析

2.1 lxz-41菌株形態及鑒定

圖1a為菌株lxz-41在硒平板上培養24 h后的形態,從圖1a中可以看出,菌株lxz-41能夠在硒平板上生長,并且能夠將亞硒酸鈉還原成紅色的胞內納米硒。圖1b是lxz-41經過戊二醛固定凍干后的電鏡照片,可以看出菌體形態短桿狀,兩端橢圓,并且在培養基上形成褶皺。所以,由此可初步判斷lxz-41可能是能夠合成納米硒的芽孢桿菌。

圖1 菌株lxz-41硒平板與SEM形態Fig.1 Selenium plate and SEM morphology of strain lxz-41注:a:菌株lxz-41在1000 mg/L亞硒酸鈉平板上的形態;b:菌株lxz-41在SEM下的形態(×1000)。

以菌株lxz-41總DNA為模板,采用細菌16S rDNA通用引物5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′ 5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進行lxz-41 16S rDNA擴增,擴增產物見圖2,大小為1500 bp左右的產物,切割目的條帶,并用SK8131純化試劑盒純化后,送樣測序。產物測序后,獲得1404個堿基,并通過NCBI數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對后發現,菌株lxz-41屬于芽孢桿菌屬,并與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)、中川芽孢桿菌(Bacillusnakamurai)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)等序列相似度達到99%,利用MEGA 5.0 中N-J法構建系統進化樹,如圖3a,lxz-41與解淀粉芽孢桿菌的進化關系最為相近。進一步用Biolog GenIII細菌鑒定平板進行lxz-41的生理生化鑒定,結果如圖3b顯示,在71種C源中,lxz-41能夠明顯利用葡萄糖、乳糖等32種碳源,對蜜二糖、D-半乳糖等24種碳源呈現半利用狀態,對D-果糖、葡萄糖醛酸等15種碳源完全無法利用。在23種化學因子中,對pH、氯化鈉濃度、鹽酸胍等13種化學因子展現較強的敏感性,而對醋竹桃霉素、利福霉素SV、潔霉素等10種化學藥物不敏感。通過以上生理生化指標與Biolog數據庫比對,并結合系統進化樹的結果,確定lxz-41為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖2 lxz-41 16srDNA 擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of lxz-4116S rDNA amplification products

圖3 lxz-41 系統進化樹(a)及Biolog GenIII 平板(b)Fig.3 Phylogenetic tree(a)and biologGenIII result(b)of lxz-41注:圖3b中GenIII 96孔板中碳源及化學因子種類的分布見Biolog說明書。

2.2 菌株lxz-41對亞硒酸鈉的耐受性

圖4顯示lxz-41對亞硒酸鈉的耐受情況,可以看出隨著亞硒酸鈉濃度的升高,生物量(以OD600 nm表示)總體呈降低趨勢,說明亞硒酸鈉的加入對菌體的生長造成了一定的影響,相應的轉化率也逐漸降低。當亞硒酸鈉添加濃度為4500 mg/L時,培養18 h后,lxz-41的OD值為0.175,說明菌株lxz-41在液體條件下,仍然能夠在含高濃度的亞硒酸鈉培養基中緩慢生長,高于已報道的酵母菌[17]、乳酸菌[18]對亞硒酸鈉的耐受能力。在亞硒酸鈉添加濃度為1500 mg/L以下時,對生物量積累的影響不大,轉化率也維持在60%左右的水平,在亞硒酸鈉1000 mg/L及以下時轉化率雖然保持在較高水平,但合成的納米硒的總量比較低,由此,結合納米硒的合成總量,本實驗選取1500 mg/L作為亞硒酸鈉的添加量進行后續實驗。圖5為菌株lxz-41發酵合成的納米硒的掃描電鏡,從圖中可以明顯看出納米硒的顆粒形態,粒徑大約在300 nm左右。說明lxz-41能夠通過發酵合成納米形態的硒顆粒。

圖4 lxz-41對亞硒酸的耐受濃度Fig.4 Tolerance concentration of lxz-41 to selenite

圖5 lxz-41合成的納米硒掃描電鏡(×10000)Fig.5 Scanning electron microscope ofsynthesized nano-selenium(×10000)

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 碳源種類對納米硒轉化的影響 圖6對比了四種不同常規碳源對菌株納米硒轉化率的影響?？梢钥闯?蔗糖與葡萄糖為碳源比飴糖和可溶性淀粉為碳源的轉化率更高,以蔗糖為碳源時,在1500 mg/L亞硒酸鈉添加量下,納米硒的轉化率為74.4%±5.1%,顯示蔗糖相比于葡萄糖明顯更有利于菌株lxz-41在硒環境中對硒的轉化,所以選定蔗糖作為納米硒轉化的碳源。圖7考察了不同蔗糖濃度對納米硒轉化率的影響。可以看出,隨著蔗糖濃度的提高,納米硒轉化率呈現了先上升后下降的趨勢,當蔗糖濃度為4%時,納米硒轉化率最高為76.1%±2.8%。所以選定4%的蔗糖濃度為后續響應面試驗的考察濃度。

圖6 碳源種類對納米硒轉化率的影響Fig.6 Effect of carbon source typeson conversion rate of nano-selenium

圖7 蔗糖濃度對納米硒轉化率的影響Fig.7 Effect of sucrose concentrationon conversion rate of nano-selenium

2.3.2 氮源種類及濃度對納米硒轉化的影響 圖8對比了有機氮、無機氮不同種類對菌株轉化納米硒的影響。結果顯示,總體來看,有機氮的納米硒轉化率要優于無機氮源的納米硒轉化率。在有機氮種類中酵母粉是最適合的有機氮源,納米硒轉化率極顯著高于其他有機氮源(P<0.01),無機氮源中尿素對菌體轉化納米硒具有極顯著的促進作用(P<0.01)。所以選取酵母粉作為最佳的有機氮源,尿素作為最佳的無機氮源。

圖8 氮源種類對納米硒轉化率的影響Fig.8 Effect of nitrogen source specieson conversion rate of nano-selenium

圖9考察了酵母粉的不同濃度對納米硒轉化率的影響。從圖9中可以看出,當酵母粉濃度在3%以下時,轉化率維持在60%以上,且相差不明顯。高于4%后,納米硒的轉化率降低,主要原因是因為過高的氮源濃度可能對菌株造成了滲透壓力,調整期延長,在前18 h的生長率較低,所以造成了納米硒的轉化率隨著氮源濃度的增大而降低。當酵母粉的濃度達到6%時,未見菌體生長,納米硒轉化率為0。圖10為不同尿素濃度對納米硒轉化率的影響,從圖10中可以看出,低濃度的尿素能夠提升納米硒的轉化率,且當添加濃度為0.1%時,納米硒轉化率最高,而后隨著尿素濃度的增大,納米硒轉化率逐漸降低,0.1%的尿素添加量效果最好。所以選定1%的酵母粉作為最佳的有機氮源及濃度,0.1%的尿素作為最佳的無機氮源及濃度。

圖9 酵母粉濃度為納米硒轉化率的影響Fig.9 Effect of yeast concentrationon conversion rate of nano-selenium

圖10 尿素濃度對納米硒轉化率的影響Fig.10 Effect of urea concentrationon the conversion rate of nano-selenium

2.3.3 不同初始pH對納米硒轉化的影響 圖11顯示了培養基不同初始pH下菌株對納米硒轉化率的影響。從圖11中可以看出,在pH5～10范圍內,隨著pH的升高,轉化率逐漸升高,當pH達到7.0時,最大轉化率為62.9%±3.4%,但在pH為7、8、9時,菌株納米硒的轉化率變化并不明顯。所以,選擇初始pH=7.0作為最佳的培養基初始pH。

圖11 初始pH對納米硒轉化率的影響Fig.11 Effect of initial pH on theconversion rate of nano-selenium

2.3.4 不同培養溫度對納米硒轉化的影響 圖12顯示了不同培養溫度對菌體轉化納米硒的影響.從圖12中可以看出,隨著培養溫度的升高,納米硒轉化率呈現先上升后下降的趨勢,原因可能是因為隨著培養溫度的升高,菌株的代謝活性增強,轉化納米硒的能力也增強,40 ℃時,轉化率為74.1%±2.1%。但當培養溫度達到45 ℃時,菌株生長受阻,納米硒的轉化率也降低。所以,選擇培養溫度為40 ℃作為下一步響應面試驗考察的水平。

圖12 培養溫度對納米硒轉化率的影響Fig.12 Effect of culture temperatureon conversion rate of nano-selenium

2.3.5 不同搖床轉速對納米硒轉化的影響 通常情況下,對好氧微生物來說,高的通氧量有利于好氧微生物的生長和代謝。圖13顯示了不同搖床培養轉速條件對菌株轉化納米硒的影響。隨著轉速的提高,培養基中溶氧加大,納米硒的轉化率也有所提高,但當轉速升高到160 r/min時,轉化率達到64.3%±2.5%,而后隨著轉速的增大,納米硒轉化率變化不大。所以選定搖床轉速為160 r/min作為納米硒轉化的最佳搖床轉速。

圖13 搖床轉速對納米硒轉化率的影響Fig.13 Effect of shaking speed on conversionrate of nano-selenium

2.4 響應面試驗結果

根據2.3單因素實驗的分析結果,以納米硒轉化率為響應值,選取對菌株影響顯著的因素(蔗糖濃度、尿素濃度、培養溫度)進行響應面試驗,應用Design Expert 8.0對實際結果與預測值進行分析對比,如表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiment

圖14顯示了變量A、B、C的交互作用響應面圖,從圖14中可以看出,響應面存在極大值,且靠近中心點附近。AB、AC交互作用的等高線呈橢圓形狀,說明對響應值的影響顯著,與方差分析結果一致。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

圖14 各變量之間的交互作用對納米硒轉化率的影響Fig.14 The effect of interaction between variousvariables on the conversion rate of nano-selenium

注:**表示極顯著(P<0.01),*表示顯著(P<0.05)。對變量A、B、C分別求一階偏導,得到編碼數據A=0.32,B=0.08,C=0.17,對應實際變量參數A(蔗糖濃度)為4.32%,B(尿素濃度)為0.10%,C(培養溫度)為40.51 ℃,在此條件下的理論Y值(納米硒轉化率)為83.6%。鑒于實驗的可操作性,將響應面優化的因素最佳條件調整為蔗糖4.5%,尿素濃度0.1%,培養溫度40.5 ℃,其它條件為酵母粉1%,磷酸氫二鉀0.3%,磷酸二氫鉀0.1%,氯化鈉0.5%,亞硒酸鈉0.15%,初始pH為7.0,培養溫度40.5 ℃,轉速160 r/min,培養18 h,納米硒轉化率為86.8%±4.7%,高于理論預測值,且相對誤差為3.8%,說明此模型能夠較好地反映實驗的各因素與響應值的實際關系。

2.5 lxz-41在獼猴桃富硒種植中的應用

按照1.2.5制備微生物源納米硒肥,并將其在陜西獼猴桃基地進行應用,應用品種為翠香和華優兩個品種,經過生長期兩次噴灑后,果皮、果肉、枝葉中硒的含量見表5。

表5 微生物納米硒對獼猴桃的富硒效果Table 5 Selenium enrichment effect ofmicrobial nano-selenium on kiwifruit

注:“N”表示未檢出硒。

從表4中可以看出,在獼猴桃栽培過程中,添加亞硒酸鈉和納米硒都能提高獼猴桃果實、枝葉中硒的含量,但微生物源納米硒對獼猴桃的富硒能力要優于亞硒酸鈉,且不會造成對土壤的污染。硒在獼猴桃各個部位的富集順序都是枝葉>果皮>果肉,說明硒元素在枝葉中的富集能力要強于果實中的富集能力。通過對比文獻發現,獼猴桃果實的富硒能力要低于稻米[19]、玉米[20]、高于晚秋黃梨[21],不同品種的獼猴桃富硒效果不同,在本次實驗的獼猴桃品種中,翠香品種要稍優于華優。根據HB001/T-2013中國富硒食品含量分類標準規定水果及其制品中硒含量為0.01～0.050 mg/kg,本次實驗的獼猴桃均符合標準要求。

3 結論

利用16S rDNA分子鑒定手段和Biolog GenIII平板對實驗室保藏的一株納米硒合成細菌lxz-41進行了鑒定,初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),并通過對亞硒酸鈉的耐受性實驗發現,該菌株具有較強的亞硒酸耐受能力,在18 h內能夠耐受4500 mg/L的亞硒酸鈉。以納米硒轉化率為指標通過單因素與響應面實驗優化了菌株lxz-41轉化合成納米硒的培養基組分及培養條件,優化后的納米硒轉化條件為:蔗糖4.5%,尿素0.1%,酵母粉1%,磷酸氫二鉀0.3%,磷酸二氫鉀0.1%,氯化鈉0.5%,初始pH為7.0,培養溫度40.5 ℃,搖床轉速160 r/min,在此條件下,納米硒的最高轉化率為86.8%±4.7%。將利用lxz-41菌株制備的微生物納米硒用于富硒獼猴桃華優和翠香品種的栽培中,經檢測獼猴桃果肉中硒含量分別達到了0.035、0.05 mg/kg,且展現了比無機硒(亞硒酸鈉)更好的效果,為將來富硒獼猴桃的綠色栽培和其它作物的富硒種植提供參考。