污水中具有絮凝作用絲狀菌的分離鑒定及性能研究

雒曉芳1,蘇 強2,陳麗華,*,張 巍2,于加瑞

(1.西北民族大學實驗教學部,甘肅蘭州 730030;2.西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030;3.西北民族大學化工學院,甘肅蘭州 730030)

我國是一個水資源短缺的國家,人均水資源僅為世界平均水平的1/4。不僅如此,我國水資源除匱乏外還面臨著嚴峻的污染問題。據統計約有90%的污水因得不到應有的治理而直接排放到江河湖海中,導致大面積水資源受到不同程度的污染,直接影響人們的生活和工農業生產,成為關系到國計民生的重要問題。因此除節約用水、合理規劃用水外,推廣治污防污對我國環境建設、經濟發展、提高人們生活質量有著重要的現實意義[1-3]。生活污水、各類工業廢水及養殖廢水等,均含有種類繁多且數目不定的懸浮體和膠體微粒,可通過生物處理、離子交換、吸附、化學氧化、電滲析、超濾和絮凝沉淀等方法去除。其中絮凝沉淀法與其它方法相比經濟較為低廉、操作更為簡便。絮凝沉淀的實施通常為向待處理水體中加入一定量的絮凝劑,迫使膠體體系在所添加絮凝劑的影響下彼此接觸、碰撞、脫穩而凝聚在一起獲得一定粒徑的聚合顆粒物,最終在重力作用下沉淀于液體底部而被分離[4-5]。

微生物絮凝劑(Microbial Flocculants,簡稱MBF)即利用微生物技術,由細菌、真菌等微生物發酵后對次級代謝產物提取精制而成的絮凝劑,主要包括蛋白質、多糖、脂類、維生素,DNA等生物大分子物質。因為這類絮凝劑高效、沉淀物較少,克服了無機和有機絮凝劑在使用安全和環境污染方面的問題,可被生物降解,所以自1976年具有絮凝能力的微生物被從霉菌、細菌、放線菌、酵母菌中篩選出后,國內外專家學者們對這類絮凝劑產生菌的篩選、產絮微生物產絮培養基成分及培養條件的優化、微生物絮凝劑絮凝活性影響因素的優化、分子結構、活性中心、作用機理及這類絮凝劑在各類廢水處理方面的應用進行了大量的研究[5-11]。

水質評價指按照評價目標,選擇相應的水質參數、水質標準和評價方法,對水體的質量、利用價值及水的處理要求作出評定。水質評價是合理開發利用和保護水資源的一項基本工作。在無規定水質標準的情況下,可采用水質基準或本水系的水質背景值作為評價標準。經過持續治理,近年來臨淄地區的污染情況有所改善,但部分地區受污依然嚴重。

因此本實驗以山東省臨淄區污水作為樣本,篩選具有絮凝活性的絲狀菌,通過培養后觀察菌落形態和個體顯微特征鑒定菌株,對絮凝作用最好的菌株進行一系列鑒定。并對所篩選的菌株的培養溫度、培養基初始pH、種子液接入量等條件進行優化以獲得更高的絮凝效果,此研究為微生物絮凝劑研究及水體治理方面提供一定的理論和實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

污水樣本 采集自山東省臨淄區金嶺回族鎮污水水渠;葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈣、氯化鉀 杭州微生物有限責任公司;馬鈴薯 甘肅榆中;高嶺土 陜西韓城;瓊脂、10 mg/mL核糖核酸酶(RNase)、異丙醇、70%乙醇、無水乙醇、10%十二玩基磺酸鈉(SDS)、麥芽汁瓊脂培養基、查氏培養基 以上試劑均購買于杭州微生物有限責任公司;純化水 經Millipore過濾滅菌。

YXQ-LS-立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;DHG-9140A新型電熱恒溫鼓風干燥箱 寧波江南儀器廠;ZWY-200D恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;S.SW-CJ-2F凈化工作臺 上海躍進醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種富集培養與初篩 將取自臨淄區4 ℃保藏的污水樣本用蒸餾水分別梯度稀釋至10-1～10-7,將稀釋后的樣本在麥芽汁瓊脂培養基中涂布(28 ℃培養72 h),篩選出生長良好且菌落單一的菌株接種于相應的50 mL麥芽汁培養基中,在溫度28 ℃,轉速150 r/min條件下,恒溫搖床擴大培養72 h對該菌株進行富集。并測定各麥芽汁培養液對高嶺土懸液的絮凝活性。若能獲得較好絮凝活性則對該富集培養液連續富集培養三次。如果該培養液仍保持其絮凝活性,用平板稀釋法進行菌株的分離純化,通過肉眼對培養特征的觀察淘汰非絲狀菌菌落特征的菌株。將所得到的單菌株接到斜面上28 ℃培養72 h后置冰箱4 ℃保存、備用。

1.2.2 菌種純化與復篩 對初篩獲得的菌株平板劃線進行純化分離,28 ℃條件下恒溫培養并觀察菌落生長情況。待菌落充分生長選單個菌落接種于裝有50 mL滅菌培養基的250 mL錐形瓶中擴大培養72 h,培養條件與初篩相同,重復3次。

1.2.3 種子液制備 將分離純化后的菌株直接接種于裝有50 mL滅菌培養基的250 mL錐形瓶中150 r/min條件下培養72 h。

1.2.4 絮凝活性測定 以高嶺土懸濁液模擬實際廢水作為絮凝對象。絮凝劑的絮凝活性用絮凝率表征。按照5 g/L的比例稱取高嶺土溶解于蒸餾水中,配制成高嶺土懸濁液。量取80 mL高嶺土懸濁液加入到100 mL的具塞量筒中,然后向量筒中加入5 mL 10 g/L的CaCl2溶液,搖勻,接著吸取2 mL 28 ℃培養72 h后的培養液(絮凝劑)加入量筒中,加蒸餾水至100 mL刻度線處,蓋塞反復顛倒搖動20次,搖勻后靜置5 min,在70 mL刻度線處吸取上清液5 mL,在550 nm處測定吸光度。同時以不加絮凝劑的上清液作為對照,樣品的絮凝活性FA按公式[12]:

FA%=(ODC-OD)/ODC×100

式(1)

式中:ODC為對照上清液的光密度值,OD為樣品上清液的光密度值。

1.3 菌株鑒定

根據菌株培養特征及顯微鏡下形態特征觀察鑒定菌株,并對其中絮凝能力最強的一株菌提取DNA,750 bp條帶濃度為60 ng/3uL,顯示為加亮帶,其余條帶濃度均為30 ng/3uL。電泳方向從下向上。純化后由武漢金開瑞生物工程有限公司通過PCR擴增和鑒定。具體為:

使用特異性引物對該菌18S rDNA進行PCR擴增,18S引物序列:ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG。該反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s;72 ℃ 1 min;35cycle;72 ℃ 10 min;12 ℃ forever。并對其18S rDNA基因進行測序。將測序結果進行正反序列拼接得到全序列,再將測序結果經NCBI進行Blast比對,并與GenBank中相近的模式菌的內轉錄間隔區(internal transcribed spacers,ITS)基因序列一并調入MEGA5.0中進行分析。利用MEGA5.0軟件進行分析,并構建系統發育樹[13-14]。

1.4 培養條件優化

影響微生物產生絮凝效應的因素眾多,各因素對不同微生物產生絮凝作用的影響程度又不盡相同。該步實驗在確保培養基種類、通氣量等眾多影響因素不變的情況下,僅通過改變單一因素包括培養溫度、發酵液初始值,種子等探討各因素對菌株絮凝能力的影響,并通過正交實驗的方法確定各因素間對絮凝作用影響程度的大小[15]。

1.4.1 培養溫度的影響 本實驗在初始pH6.0,種子液加入量5%的條件下,設計22、24、26、28、30、32 ℃,6個不同的溫度梯度,將種子液在150 r/min條件下,恒溫搖床培養72 h測定發酵液的絮凝活性,分析培養溫度對菌株絮凝效果的影響。

1.4.2 發酵液初始pH的影響 實驗以一定濃度NaOH和HCl溶液來調節絮凝培養基的初始pH,在培養溫度為28 ℃,種子液加入量為5%的條件下,改變從5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,5個不同初始pH,測定發酵液的絮凝率,分析發酵液初始pH對絮凝效果產生的影響。

1.4.3 種子液加入量的影響實驗 在培養溫度為28 ℃,初始值為自然狀態的條件下,設計2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%,6個不同種子液加入量,測定發酵液的絮凝率,分析種子液加入量對絮凝效果產生的影響。

1.4.4 正交實驗 在對菌株單因素實驗基礎上采用正交實驗來探討種子液加入量,初始pH和培養溫度這三個影響因素對各菌株所對應培養液絮凝率的影響情況。每個因素考察三個水平,實驗因素水平如表1所示。

表1 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface test

2 結果與分析

2.1 菌種的分類鑒定

2.1.1 菌株的形態學特征 對篩選所得的三株具有絮凝活性的菌株分別編號SP、SQ、SR。從圖1a可知,菌落在營養瓊脂培養基上28 ℃培養3 d,即形成較典型的菌落,菌落整體較為平坦中心有臍狀突起而其他部分有少量放射狀短紋,邊緣明確、整齊,質地絨狀分生孢子面暗綠色;菌絲體為白色,具隔膜;油鏡下觀察分生孢子梗發生于基質,壁平滑,帚狀枝為雙輪生彼此夾角較小彼此較緊貼,梗基每輪2～3個,瓶梗每輪5～8個,分生孢子為橢圓形,壁平滑,分生孢子鏈圓柱狀。根據該菌株的培養特征及乳酸石炭酸棉藍染液染色后顯微鏡下形態觀察進行鑒定[15-17],確定該菌株屬于半知菌類、叢梗孢目、叢梗孢科,青霉屬,由于該屬菌種眾多形態又極為相似,因此對該菌的鑒定工作還應依賴于對其18S rDNA測序比對確定。

圖1 各菌株的培養特征和形態特征Fig.1 The culture characteristics and morphologicalcharacteristics of the strain

圖3 SP菌株系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of the SP strain

從圖1b可知,菌落在營養瓊脂培養基上28 ℃培養3 d,即形成較典型的菌落,中心有突起,質地絮狀兼絨狀,邊緣整齊,邊緣的菌絲體淡藍色,中部呈淡黃白色,反面微紅褐色;分生孢子梗莖壁平滑;帚狀枝雙輪生,梗基每輪2～4個,瓶梗每輪3～5,披針形,梗頸明顯;分生孢子呈現卵圓形,壁平滑;分生孢子鏈疏松而不規則。根據該菌的培養特征及乳酸石炭酸棉藍染液染色后顯微鏡下形態觀察進行鑒定,初步鑒定該菌為半知菌類、叢梗孢目、叢梗孢科,青霉屬某菌,目前尚不足以鑒定出具體種屬。

從圖1c可知,菌落在查氏培養基上28 ℃培養4 d,即形成較典型的菌落,菌落呈白色、毛絨狀,中心突起;無隔,形成的單孢子呈長筒形。根據該菌的培養特征及乳酸石炭酸棉藍染液染色后顯微鏡下形態觀察,初步鑒定該菌為叢梗孢科某絲狀菌。

2.1.2 鑒定結果 考慮到SQ、SR絮凝活性都低于SP的絮凝活性,且實驗經費有限,固只對SP進行了進一步的鑒定。將所得序列與NCBI中Gen Bank的核酸序列進行BLAST比對分析,結果顯示實驗菌株SP與草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)相似度最高。不過由于該序列與該屬多個種的相似度均很高,為了更準確菌株種類,還需要進一步確定[18-19]。如圖2瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物所示,750 bp條帶濃度為60 ng/3 uL,顯示為加亮帶,其余條帶濃度均為30 ng/3 uL,電泳方向從下向上。左側條帶為marker,右側為SP的PCR產物條帶,SP菌株PCR產物的條帶1700 bp左右。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物Fig.2 The PCR products were detectedby agarose gelelectrophoresis

2.1.3 SP菌株系統發育樹的建立 SP菌株與從GENBANK獲取的相似序列經MEGA5.0軟件進行比對分析并構建N-J系統發育樹。根據系統發育樹并結合各比對指標確定距離與同源性均具有較大鑒定意義(Identfication)的比對序。選取草酸青霉菌屬的14個種的模式菌株,使用Mega 5.0軟件進行系統進化樹的構建,自展值(Bootstrap value)設置為10000。如圖3所示,由構建的進化樹可以初步判定SP菌株與草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)屬于同一種[20]。

2.2 絮凝條件優化

2.2.1 不同溫度對絮凝效果的影響 如圖4所示,培養溫度的變化,會影響菌液的絮凝效果的變化,SP(草酸青霉菌)在28 ℃條件下表現出最佳絮凝效果,絮凝率可達到67.7%,SQ(青霉屬絲狀菌)在26 ℃條件下表現出最佳絮凝效果,絮凝率可達到58.4%,而SR(叢梗孢科真菌)30～32 ℃才出現最佳絮凝效果,且絮凝率也較低,只能達到30.4%。

圖4 不同溫度下菌株絮凝率的變化Fig.4 The change of flocculationrate at different temperatures

2.2.2 不同初始pH對絮凝效果的影響 如圖5所示,當pH處于6時草酸青霉菌絮凝率可達到65.8%,而其余兩株菌均在pH為7時表現最佳絮凝效果,絮凝率分別為57.4%和25.3%,且當pH大于7時絮凝效果明顯下降,因此三株菌的最佳培養pH均在6～7之間。

圖5 不同初始pH下絮凝率的變化Fig.5 The changes of flocculationunder different initial pH values

2.2.3 種子液加入量對絮凝效果的影響 如圖6所示,三種菌的絮凝效果受種子液加入量的影響并不是非常明顯,絮凝率變化均保持在15%以內,且在加入量為3 mL,即種子加入濃度為6%時表現出最佳絮凝效果。

圖6 不同種子液加入量下絮凝率的變化Fig.6 The change of flocculation rateat different amount of seed fluid added

2.3 正交實驗

在單因素實驗的基礎上,選擇種子液加入量、pH、培養溫度進行3因素3水平正交試驗,試驗結果如表2～表4所示。

表2 SP菌株實驗設計及結果Table 2 Design and results of the SP strain

由極差分析可得各因素對SP菌株絮凝活性的影響的大小為:C>B>A;通過比較K值大小確定最優水平組合為A2B1C2,即種子加入量4 mL,pH為6,培養溫度為28 ℃。在該條件下進行驗證試驗,SP菌株絮凝活性為67.7%。對SQ菌株絮凝活性的影響的大小為:B>A>C;通過比較K值大小確定最優水平組合為A2B2C2,即種子加入量為4 mL,pH為7,培養溫度為28 ℃。在該條件下進行驗證試驗,SQ菌株絮凝活性為58.2%。對SR菌株絮凝活性的影響的大小為:B>A>C;通過比較K值大小確定最優水平組合為A2B2C2,即種子加入量為4 mL,pH為7,培養溫度為28 ℃。在該條件下進行驗證試驗,SR菌株絮凝活性為31.4%[21-24]。

表3 SQ菌株實驗設計及結果Table 3 Design and results of the SQ strain

表4 SR菌株實驗設計及結果Table 4 Design and results of the SR strain

3 討論與結論

近年來,生物技術不斷發展,新的技術也不斷用于微生物絮凝劑的研究,微生物絮凝劑技術的發展已經進入到了一個新的歷史階段[21]。于榮麗等[22]對LMB8菌株進行了產絮凝劑的優化培養后,加入助凝劑CaCl25 mL,LMB8菌株所產絮凝劑對河道泥漿的絮凝率可達83.1%。LMB8菌體本身則不具有絮凝性,其有效絮凝性物質是該菌體在發酵過程中產生的胞外分泌物。該實驗借助正交實驗設計,對培養溫度、發酵液初始pH,種子液加入量三因素對菌株絮凝作用進行了優化處理,結果表明,影響絮凝率的程度依次為:初始pH>培養溫度>種子液加入量。除種子液加入量外,其他兩個因素都可直接影響細胞內酶的合成,改變酶促反應速率甚至影響次級代謝,所以培養溫度及發酵液初始pH對菌株絮凝作用影響較大。另外,實驗發現,SP(草酸青霉菌)、SQ(青霉屬絲狀菌)、SR(叢梗孢科絲狀菌)3種絲狀菌均有一定的產絮凝活性,其中最佳培養條件是:麥芽汁培養基、初始pH6.0、150 r/min搖床培養72 h、培養溫度28 ℃,而且以草酸青霉菌最為顯著,對5g/L的高嶺土懸浮液的處理中可達到65.45%的絮凝率,可見,該研究為不僅豐富了污水中絮凝微生物的品種,而且該菌株的絮凝率相對較高,故其后期在治理污水等方面研究價值也很大,有一定的應用潛力。