一株桃褐腐病生防酵母菌活性?xún)龈煞鄣闹苽浼氨ｕr應(yīng)用

周秋陽(yáng),楊慧慧,王 玲,毋寧寧,高興彪,孫衛(wèi)紅

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212

桃褐腐病是一種世界范圍內(nèi)的真菌性病害,主要由美澳型核果鏈核盤(pán)菌(Moniliniafructicola)引起,桃果實(shí)感染此病后極易腐爛,給水蜜桃采后的貯藏、運(yùn)輸和銷(xiāo)售帶來(lái)了極大的困難[1]。目前,水蜜桃的采后保鮮仍舊采用傳統(tǒng)方法,如冷藏、氣調(diào)、紫外照射等物理方法以及使用各類(lèi)廣譜殺菌劑[2]。但這些方法往往伴隨著資金高投入、能源高消耗、農(nóng)藥高殘留等諸多問(wèn)題,因此安全高效的生物防治成為國(guó)內(nèi)外果蔬采后貯藏保鮮的研究熱點(diǎn)。

現(xiàn)代生物防治主要是利用微生物間的拮抗作用,通過(guò)生防菌、病原微生物和宿主之間的相互作用,進(jìn)而達(dá)到防治果蔬采后病害的目的。當(dāng)前主要使用的拮抗微生物有拮抗細(xì)菌、拮抗霉菌和拮抗酵母菌,而拮抗酵母菌更因其抑菌譜性廣、安全性高、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)而被廣泛關(guān)注[3]。拮抗酵母菌的主要抑菌機(jī)制有:營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)、重寄生作用、水解酶的分泌、誘導(dǎo)宿主抗性提高[4]。龍超安將拮抗菌株34-9接種到柑橘傷口處,48 h后酵母菌數(shù)量即可增漲到20倍以上,能有效防治柑橘青霉病[5];劉程惠等[6]用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),拮抗假絲酵母菌能夠很好地吸附在病原菌菌絲表面,并使附著點(diǎn)處病原菌細(xì)胞壁出現(xiàn)溶解;羅琳等[7]發(fā)現(xiàn)酵母菌株G5能夠誘導(dǎo)宿主體內(nèi)多酚氧化酶(PPO)和過(guò)氧化物酶(POD)等抗性酶活性的增加。

冷凍干燥是目前制備微生物固體制劑最常用的方法,但是低溫干燥過(guò)程中往往會(huì)造成細(xì)胞的損傷、死亡以及某些生物功能的改變[8]。因此,通常在菌體冷凍之前加入不同類(lèi)型的保護(hù)劑以改變細(xì)胞所處的物理、化學(xué)環(huán)境,從而減輕凍干過(guò)程對(duì)細(xì)胞的損害[9]。唐飛等[10]單獨(dú)使用海藻糖作為凍干保護(hù)劑,凍干后酵母菌存活率為42%,而對(duì)照組僅為3%;王華等[11]發(fā)現(xiàn)用14.15 g/100 mL蔗糖、7.07 g/100 mL谷氨酸鈉、1.1 g/100 mL聚乙二醇作為凍干保護(hù)劑時(shí),熱帶假絲酵母凍干存活率高達(dá)81.46%。

本研究以一株從桃樹(shù)枝葉上分離得到的,能夠顯著抑制桃褐腐病的間型假絲酵母菌Y-17為研究對(duì)象,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)篩選得到該酵母菌株的復(fù)合凍干保護(hù)劑配方,對(duì)所制備的活性?xún)龈煞圻M(jìn)行生防效力和存放效力的評(píng)價(jià),并將其在水蜜桃采后貯藏保鮮方面進(jìn)行初步應(yīng)用,以明確其在水蜜桃貯藏期間的抑菌效果和保鮮效果,為間型假絲酵母菌Y-17在桃褐腐病生物防治方面的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試病原菌 美澳型核果鏈核盤(pán)菌,從中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏中心(CFCC)購(gòu)得,其CFCC編號(hào)為80648;供試拮抗酵母 由本實(shí)驗(yàn)室從桃樹(shù)枝葉上分離得到,能夠顯著抑制桃褐腐病的間型假絲酵母菌Y-17菌株,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏號(hào)為NO:M 2018054,該酵母菌株經(jīng)小鼠急性經(jīng)口實(shí)驗(yàn)證明為實(shí)際無(wú)毒型酵母;供試水果 “白鳳”水蜜桃,從鎮(zhèn)江市一有機(jī)桃園采摘無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病害、大小均一、7～8分成熟的水蜜桃,并于當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室;海藻糖、甘露醇、山梨醇、脯氨酸、谷氨酸鈉、β-環(huán)糊精、麥芽糊精、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、酚酞、抗壞血酸 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HVE-50全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama;H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司;ULT1386-3-V40超低溫冰箱 美國(guó)賽默飛世爾公司;FD-8真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;WYA-2WAJ阿貝折光儀 杭州三永德儀器儀表有限公司;DDS-11A電導(dǎo)率儀 杭州齊威儀器有限公司;ST-Z16食品物性測(cè)試儀 山東盛泰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制及菌種活化 NYDA培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,酵母浸膏5 g,牛肉浸膏8 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,自然pH;NYDB培養(yǎng)基:NYDA培養(yǎng)基中不加瓊脂;PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,自然pH;上述培養(yǎng)基均121 ℃滅菌20 min,待用。

將病原菌菌株于PDA培養(yǎng)基上25 ℃活化2～3次,待用;Y-17酵母菌株于NYDA培養(yǎng)基上28 ℃活化2～3次,待用。

1.2.2 菌體的培養(yǎng)與收集 將活化好的酵母菌接種于NYDB液體培養(yǎng)基中(50 mL/250 mL),180 r/min,28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h;培養(yǎng)好的種子液按3%(V/V)的接種量接入NYDB培養(yǎng)基中,180 r/min,28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后,4 ℃、6000 r/min離心15 min,收集菌體沉淀[12]。

1.2.3 酵母凍干粉的制備 將1.2.2離心得到的菌體沉淀用保護(hù)劑溶液振蕩溶解,平衡30 min后分裝至直徑9 cm的培養(yǎng)皿中,控制液體厚度為5 mm左右;將樣品放入-80 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍3 h,預(yù)凍結(jié)束后迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷好的真空冷凍干燥機(jī)中,-40 ℃、10 Pa干燥36 h,最后將凍干物碾碎即得到酵母凍干粉[13]。

1.2.4 單一保護(hù)劑的篩選 選取海藻糖、山梨醇、甘露醇、脯氨酸、谷氨酸鈉、β-環(huán)糊精、麥芽糊精作為保護(hù)劑。將山梨醇、甘露醇和脯氨酸配成6個(gè)濃度梯度,分別為1、3、5、7、9、11 g/100 mL,其余保護(hù)劑溶液濃度梯度為2、5、8、11、14、17 g/100 mL,121 ℃滅菌20 min。無(wú)菌水為對(duì)照,以?xún)龈珊蟮慕湍复婊盥蕿橹笜?biāo),篩選出保護(hù)效果較好的3種保護(hù)劑。

1.2.5 復(fù)合保護(hù)劑的優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的篩選結(jié)果,采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)對(duì)山梨醇、海藻糖和谷氨酸鈉的配比進(jìn)行優(yōu)化,以?xún)龈珊蟮慕湍复婊盥蕿轫憫?yīng)值,確定間型假絲酵母Y-17冷凍干燥保護(hù)劑的最佳配方,試驗(yàn)因素水平設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of responsesurface central composite design

1.2.6 酵母存活率的計(jì)算 酵母凍干粉用無(wú)菌水復(fù)水至凍干前體積,于28 ℃水浴鍋中活化30 min,通過(guò)稀釋涂布進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[14],酵母存活率的計(jì)算公式為:酵母存活率(%)=(凍干后活菌數(shù)/凍干前活菌數(shù))×100。

1.2.7 酵母凍干粉生防效力的評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了酵母菌凍干粉和新鮮酵母菌對(duì)水蜜桃褐腐病的生防效力,以驗(yàn)證所制備的凍干粉生防效力并未因干燥處理而減弱。取上述洗凈消毒(用0.1% NaClO消毒并清水沖洗)的水蜜桃,用無(wú)菌打孔器在每個(gè)水蜜桃的陽(yáng)面赤道處打一個(gè)直徑為5 mm,深3 mm左右的孔。

實(shí)驗(yàn)組1∶1.2.5中最優(yōu)條件下制備的凍干粉用無(wú)菌水溶解混勻,并調(diào)節(jié)菌體濃度至1×108CFU/mL,吸取10 μL酵母懸液接種到水蜜桃傷口處。

實(shí)驗(yàn)組2∶1.2.2中振蕩培養(yǎng)24 h的新鮮酵母發(fā)酵液,6000 r/min離心15 min,用無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌體濃度至1×108CFU/mL,吸取10 μL酵母菌液種到水蜜桃傷口處。

對(duì)照組:吸取10 μL無(wú)菌水接種到傷口處。

接種后的水蜜桃于室溫放置2 h,吸取10 μL濃度為5×104CFU/mL的美澳型核果鏈核盤(pán)菌孢子懸液接入傷口處。將處理后的水蜜桃放入塑料框中,并用保鮮膜包裹好,置于28 ℃、相對(duì)濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行貯藏。5 d后觀察并記錄各組水蜜桃的腐爛情況,按照如下公式計(jì)算桃果實(shí)的發(fā)病率,病斑直徑取垂直兩個(gè)方向病斑長(zhǎng)度的平均值。每個(gè)處理選用10個(gè)桃果實(shí),平行3次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。發(fā)病率計(jì)算公式為:發(fā)病率(%)=處理組果實(shí)發(fā)病數(shù)/處理組果實(shí)個(gè)數(shù)×100。

1.2.8 酵母凍干粉貯藏期間活性的評(píng)價(jià) 將1.2.5中最優(yōu)條件下制備的酵母凍干粉立刻轉(zhuǎn)移至密封袋中,分別置于25、4、-20 ℃三個(gè)溫度條件下進(jìn)行貯藏。分別于0、30、60、90、120、150、180 d,準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g凍干粉,溶解于1 mL無(wú)菌水中,28 ℃水浴活化30 min,稀釋涂布,計(jì)算各貯藏溫度下酵母菌的存活率。

1.2.9 酵母凍干粉對(duì)水蜜桃保鮮效果的評(píng)價(jià) 將1.2.5中最優(yōu)條件下制備的酵母凍干粉用去離子水溶解,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108CFU/mL,然后對(duì)水蜜桃做以下處理:凍干粉處理組:將水蜜桃在上述菌液中浸泡10 min,取出后自然晾干;去離子水處理組:將水蜜桃在去離子水中浸泡10 min,取出后自然晾干;空白對(duì)照組:不做任何處理。將各個(gè)處理的水蜜桃放入塑料框中并用保鮮膜密封,于25 ℃,相對(duì)濕度75%條件下貯藏。貯藏期間,每天定時(shí)測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2.9.1 桃果實(shí)腐爛指數(shù)的測(cè)定 依據(jù)水蜜桃腐爛情況劃分為5個(gè)等級(jí),無(wú)腐爛的為0級(jí);腐爛面積小于果實(shí)表面積25%的為1級(jí);腐爛面積占果實(shí)表面積25%～50%的為2級(jí);腐爛面積占果實(shí)表面積50%～75%的為3級(jí);腐爛面積大于果實(shí)表面積75%的為4級(jí)。腐爛指數(shù)(%)=Σ(級(jí)別×該級(jí)別果數(shù))/(總果數(shù)×最高級(jí)別)×100。

1.2.9.2 桃果實(shí)失重率的測(cè)定 分別測(cè)量每個(gè)果實(shí)的初始重量W0及取樣時(shí)重量W1,果實(shí)失重率(%)=(W0-W1)/W0×100。

1.2.9.3 果實(shí)硬度的測(cè)定 參照趙魯寧等[15]的方法,用食品物性?xún)x進(jìn)行測(cè)量。

1.2.9.4 可溶性固形物(TSS)含量的測(cè)定 參照賀惠文[16]的方法,用阿貝折光儀進(jìn)行測(cè)量。

1.2.9.5 維生素C含量的測(cè)定 參照高海榮等[17]的方法,采用紫外法進(jìn)行測(cè)量。

1.2.9.6 可滴定酸含量的測(cè)定 參照李合生[18]的方法,采用酸堿滴定法進(jìn)行測(cè)量。

1.2.9.7 果皮細(xì)胞膜透性測(cè)定 稱(chēng)取1 g果皮用去離子水反復(fù)沖洗3遍后,于20 mL去離子水中浸泡20 min,測(cè)量其電導(dǎo)率L0,煮沸10 min迅速冷卻,再次測(cè)量其電導(dǎo)率L1,相對(duì)電導(dǎo)率(%)=L0/L1×100。

以上每種指標(biāo)的測(cè)量均做3個(gè)平行,且實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016作圖;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果取三次平行的均值,并采用SPSS 16.0進(jìn)行顯著性分析,用鄧肯氏新復(fù)極差法比較不同處理組之間的顯著性差異,設(shè)置顯著性差異水平為P<0.05;采用Design-Expert V8.0.6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,篩選出酵母凍干粉的最佳保護(hù)劑配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一保護(hù)劑對(duì)間型假絲酵母Y-17凍干存活率的影響

為了提高酵母菌凍干粉中的活菌數(shù),通常在菌體冷凍前加入各類(lèi)保護(hù)劑以維持酵母細(xì)胞的活性和穩(wěn)定性。由圖1可知,當(dāng)不加任何保護(hù)劑時(shí),菌體凍干后存活率僅有5.15%;當(dāng)加入不同保護(hù)劑后,菌體的凍干存活率隨著保護(hù)劑質(zhì)量濃度的增加而呈“先上升后降低”的趨勢(shì)。當(dāng)谷氨酸鈉、脯氨酸、β-環(huán)糊精、海藻糖、山梨醇、麥芽糊精、甘露醇的質(zhì)量濃度分別為14、3、8、11、5、11、1 g/100 mL時(shí),酵母凍干存活率最高,分別為48.74%、14.32%、19.64%、43.51%、25.06%、17.21%、18.92%;當(dāng)保護(hù)劑濃度超過(guò)其最適濃度時(shí),菌體的凍干存活率隨著保護(hù)劑質(zhì)量濃度的增加而下降,這是因?yàn)檩^高濃度的保護(hù)劑會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)的蛋白加速聚合,形成較強(qiáng)的玻璃化結(jié)構(gòu)[23]。當(dāng)海藻糖、山梨醇、谷氨酸鈉濃度分別為11、5、14 g/100 mL時(shí),對(duì)酵母菌的凍干保護(hù)效果較好。海藻糖和山梨醇均具有較多的羥基,可代替膜蛋白周?chē)乃肿优c蛋白之間形成水合鍵,穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu),防止蛋白質(zhì)因干燥失水而變性[19]。此外,海藻糖在溶液中能夠與水分子結(jié)合形成二水化合物,使得其具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,從而降低冷凍過(guò)程中冰晶對(duì)細(xì)胞的傷害[20]。而山梨醇除了能夠作為一種親水保護(hù)劑穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)外,還能作為填充劑,當(dāng)菌懸液在冷凍結(jié)晶時(shí),山梨醇能為活性組分提供很好的結(jié)構(gòu)支撐,有利于保護(hù)細(xì)胞活性[21]。谷氨酸鈉由于氨基(-NH2)和羧基(-COOH)的存在,使得其具有酸堿兩性,能夠很好地調(diào)節(jié)pH,穩(wěn)定酵母活性[22]。此外,在冷凍過(guò)程中,谷氨酸鈉還能夠穿過(guò)細(xì)胞壁,在細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間形成緩沖層,抑制冰晶的生成,保持細(xì)胞膜的完整性[23]。

圖1 各種保護(hù)劑對(duì)間型假絲酵母Y-17凍干存活率的影響Fig.1 Effect of different cryoprotectants on the survival rate ofCandida intermedia Y-17 after freeze-drying

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,僅僅使用單一的保護(hù)劑對(duì)菌體的凍干保護(hù)效果較差,即便使用保護(hù)效果最好的谷氨酸鈉,其菌體凍干存活率最高也僅有48.47%,難以滿(mǎn)足工業(yè)上生產(chǎn)活性?xún)龈煞鄣囊?而通過(guò)多種保護(hù)劑的互配則能有效提高其凍干保護(hù)效果[24]。因此,選用山梨醇、海藻糖、谷氨酸鈉3種保護(hù)劑進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì),以確定其復(fù)合保護(hù)劑的最佳配方。

2.2 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取山梨醇、海藻糖和谷氨酸鈉為考察因素,采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)對(duì)酵母凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行優(yōu)化,具體設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design-Expert軟件對(duì)表中響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析,得到優(yōu)化后的二次回歸方程:R=-364.91988+9.28697A+13.91497B+49.98053C+0.69042AB+0.3275AC+0.0475BC-2.05774A2-0.73502B2-1.93023C2。方程中R為酵母凍干存活率,A、B、C分別代表山梨醇、海藻糖和谷氨酸鈉,對(duì)上述所建模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表3所示。

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of central combination experiments

響應(yīng)面分析法不但能夠分析各反應(yīng)因素對(duì)目標(biāo)值的影響,還能對(duì)最佳反應(yīng)條件進(jìn)行預(yù)測(cè)優(yōu)化[25]。由圖2可知,A與B之間、A與C之間的等高線(xiàn)圖均為橢圓形,說(shuō)明A和B以及A和C之間均存在顯著交互關(guān)系,與方差分析結(jié)果一致。當(dāng)其中一種物質(zhì)的濃度一定時(shí),酵母凍干存活率隨著其他兩種物質(zhì)濃度的增加呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì),說(shuō)明響應(yīng)曲面中存在極大值點(diǎn),即存在保護(hù)劑最佳濃度。通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)優(yōu)化處理得到,當(dāng)山梨醇5.43 g/100 mL,海藻糖12.45 g/100 mL,谷氨酸鈉13.56 g/100 mL時(shí),酵母的凍干存活率最高,預(yù)測(cè)值為85.77%。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),最終得到間型假絲酵母Y-17的凍干存活率為84.21%±0.87%,與預(yù)測(cè)值較為接近,說(shuō)明建立的模型合理有效。

表3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface model

圖2 不同因素交互作用的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖Fig.2 Response surface and contour plots ofinteraction of different factors

注:**極顯著(P<0.01),*顯著(P<0.05)。2.3 酵母凍干粉生防效力的評(píng)價(jià)

拮抗酵母菌冷凍干燥后仍需具有較高的生防效力,這是其能應(yīng)用于果蔬采后病害防治的前提。由圖3可知,貯藏5 d后,實(shí)驗(yàn)組1用間型假絲酵母Y-17凍干粉處理水蜜桃發(fā)病率為20.63%,實(shí)驗(yàn)組2用新鮮酵母菌液處理的桃果實(shí)發(fā)病率為15.87%,兩組間無(wú)顯著差異(P>0.05),但均顯著(P<0.05)低于對(duì)照組用無(wú)菌水處理的100%發(fā)病率。此外,實(shí)驗(yàn)組1的水蜜桃病斑直徑為1.83 cm,與實(shí)驗(yàn)組2的病斑直徑無(wú)顯著(P>0.05)差異,卻顯著(P<0.05)小于對(duì)照組病斑直徑3.44 cm。綜上,活性?xún)龈煞蹖?duì)桃褐腐病的生防效力與新鮮酵母之間并無(wú)顯著(P>0.05)差異,說(shuō)明凍干粉中酵母菌細(xì)胞活力并未因干燥處理而明顯減弱,可以用于水蜜桃采后病害的防治。

圖3 不同處理對(duì)水蜜桃發(fā)病率及病斑直徑的影響Fig.3 Effects of different treatments on theincidence and the diameter of disease spots of honey peach注:不同字母表示差異顯著(P<0.05),圖4同。

2.4 酵母凍干粉貯藏期間活性的評(píng)價(jià)

酵母凍干粉在貯藏期間,其細(xì)胞活性會(huì)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低,而適宜的貯藏溫度則能有效延緩其下降速度。從圖4可知,至30 d時(shí),于25、4、-20 ℃三個(gè)溫度條件下貯藏的凍干粉復(fù)水后酵母菌存活率無(wú)顯著差異(P>0.05),分別為81.66%、82.56%、83.29%,至60 d時(shí),三組的存活率均在65%以上;60 d之后酵母菌存活率下降速度加快,于25 ℃貯藏的凍干粉酵母菌存活率下降最為迅速,至180 d時(shí),酵母菌存活率僅為15.72%;于4 ℃貯藏的凍干粉酵母菌存活率下降速度相對(duì)較慢,至120和180 d時(shí)酵母菌存活率分別為40.85%和28%;于-20 ℃貯藏的凍干粉酵母菌存活率下降速度最慢,在90～180 d期間其存活率顯著(P<0.05)高于其他兩組,貯藏至120和180 d時(shí)酵母菌存活率分別為50.6%和34.66%。綜上,酵母Y-17活性?xún)龈煞鄹m合在-20 ℃進(jìn)行貯藏。

圖4 活性?xún)龈煞墼诓煌A藏溫度下的酵母存活率Fig.4 The yeast survival rate of active freeze-driedpowder at different storage temperatures

2.5 酵母凍干粉對(duì)水蜜桃的貯藏保鮮效果

2.5.1 不同處理下水蜜桃果實(shí)腐爛指數(shù)的變化 水蜜桃采后極易發(fā)生腐爛,選擇合適的防腐方法在其采后貯藏保鮮方面至關(guān)重要。從圖5可以看出,各處理下水蜜桃果實(shí)的腐爛指數(shù)均隨著貯藏時(shí)間的增加而增加,從第3 d開(kāi)始,經(jīng)凍干粉處理的水蜜桃腐爛指數(shù)顯著(P<0.05)低于其他兩個(gè)處理;4 d之后,去離子水處理組和對(duì)照組的水蜜桃腐爛指數(shù)迅速上升,貯藏至第9 d時(shí),兩處理組的腐爛指數(shù)分別為28.27%和31.11%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于用凍干粉處理的腐爛指數(shù)6.28%。表明該生防菌劑在水蜜桃的貯藏過(guò)程中能有效抑制由病原菌生長(zhǎng)繁殖引起的桃果實(shí)腐爛,具有很好的防腐保鮮效果。

圖5 不同處理下水蜜果實(shí)腐爛指數(shù)的變化Fig.5 Changes in the decay index ofhoney peach under different treatments注:不同字母表示各處理組間差異性顯著(P<0.05)。圖6～圖11同。

2.5.2 不同處理下水蜜桃果實(shí)失重率的變化 水蜜桃含水量較高,在貯藏過(guò)程中極易失水皺縮,進(jìn)而影響其品質(zhì)。從圖6可以看出,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),桃果實(shí)的失重率也隨之增加。貯藏前5 d,用凍干粉處理的水蜜桃失重率相較于對(duì)照差別不大;而隨著后熟進(jìn)程的加快,桃果實(shí)體內(nèi)貯備的有機(jī)物被大量消耗,果實(shí)快速失重[29],5 d之后,對(duì)照組水蜜桃失重率迅速升高,顯著高于(P<0.05)凍干粉處理組;貯藏至第8 d時(shí),去離子處理組和對(duì)照組的失重率分別為5.45%和6.11%,均高于凍干粉處理組水蜜桃的失重率4.84%。表明該生防菌劑能夠在水蜜桃儲(chǔ)存過(guò)程中,通過(guò)抑菌抗病而保持果皮的完整性及延展性,從而減少桃果實(shí)的水分流失,利于水蜜桃果實(shí)的貯藏保鮮。

圖6 不同處理下水蜜桃果實(shí)失重率的變化Fig.6 Changes in the weight loss ofhoney peach under different treatments

2.5.3 不同處理下水蜜桃果實(shí)硬度的變化 硬度不僅能夠反應(yīng)桃果實(shí)軟化程度,更是評(píng)價(jià)其商品價(jià)值的重要指標(biāo)。隨著采后桃果實(shí)成熟度的增加,果肉細(xì)胞中的果膠大量水解,導(dǎo)致果實(shí)組織崩潰,硬度降低[26]。從圖7可以看出,桃果實(shí)的硬度隨著貯藏時(shí)間的增加而降低。貯藏至第4 d時(shí),凍干粉處理的桃果實(shí)硬度由16.53 kg/cm2降至9.54 kg/cm2,在此期間其果實(shí)硬度明顯大于對(duì)照組;5 d之后,桃果實(shí)成熟加快,三個(gè)處理組之間果實(shí)硬度無(wú)顯著差異(P>0.05)。表明該生防菌劑能通過(guò)抑制病原菌孢子的萌發(fā)及生長(zhǎng),從而避免病原菌對(duì)桃果實(shí)果膠的降解,有效抑制桃果實(shí)硬度的降低。

圖7 不同處理下水蜜桃果實(shí)硬度的變化Fig.7 Changes in the hardness ofhoney peach under different treatments

2.5.4 不同處理下水蜜桃果實(shí)TSS含量的變化 可溶性固形物是水果中糖、酸、維生素、礦物質(zhì)等可溶性化合物的總稱(chēng),而在水蜜桃中,可溶性固形物主要是指可溶性糖[27]。從圖8可以看出,水蜜桃采后TSS含量的變化并不呈現(xiàn)單一的上升或下降趨勢(shì)。在貯藏前期,桃果實(shí)中的大量多糖類(lèi)物質(zhì)發(fā)生水解,使得TSS含量有所上升,后期因呼吸作用消耗部分糖類(lèi)物質(zhì),TSS含量逐漸下降[28]。貯藏至第2 d時(shí),各處理組桃果實(shí)TSS含量升至峰值,其中凍干粉處理組TSS含量最高,為15%,之后隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)TSS含量呈下降趨勢(shì);從第5 d起,各處理組桃果實(shí)TSS含量:凍干粉處理組>去離子水處理組>對(duì)照組,至第7 d時(shí),凍干粉處理組TSS含量為10.67%,顯著高于(P<0.05)其他兩組。表明該生防菌劑在水蜜桃的貯藏過(guò)程中,能通過(guò)抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖,減少病原菌對(duì)桃果實(shí)糖類(lèi)物質(zhì)的消耗,以及延遲桃果后熟引起的呼吸消耗,進(jìn)而抑制桃果實(shí)中TSS含量的降低。

圖8 不同處理下水蜜桃果實(shí)TSS含量的變化Fig.8 Changes in the content of TTS ofhoney peach under different treatments

2.5.5 不同處理下水蜜桃果實(shí)VC含量的變化 水蜜桃中VC含量較高,但是其極易受到外界條件的影響而降解,因此VC含量是衡量水果采后品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[29]。從圖9可以看出,各處理組水蜜桃在貯藏期間VC含量均呈下降趨勢(shì),其中凍干粉處理組的VC含量始終高于其他兩組。貯藏前3 d,各組VC含量迅速下降;貯藏至第7 d時(shí),凍干粉處理組桃果實(shí)VC含量為2.15 mg/100 g,與其他兩處理組存在顯著差異(P<0.05),是去離子水處理組的1.4倍,對(duì)照組的1.3倍。說(shuō)明該生防菌劑能通過(guò)提高宿主抗病性,避免病原菌生長(zhǎng)繁殖對(duì)桃果的營(yíng)養(yǎng)消耗,延緩桃果實(shí)VC分解速率,有利于維持桃果實(shí)品質(zhì)。

圖9 不同處理下水蜜桃果實(shí)VC含量的變化Fig.9 Changes in the content of VC ofhoney peach under different treatments

圖10 不同處理下水蜜桃可滴定酸含量的的變化Fig.10 Changes in the content of titratable acid ofhoney peach under different treatments

2.5.6 不同處理下水蜜桃果實(shí)可滴定酸含量的變化 果實(shí)中的可滴定酸在貯藏過(guò)程中可以作為呼吸底物而被消耗,從而影響果實(shí)風(fēng)味[30]。從圖10可以看出,在整個(gè)貯藏期間,各處理組可滴定酸含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),其中凍干粉處理組可滴定酸含量始終高于其他兩組。在貯藏前4 d,凍干粉處理組可滴定酸含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05);第5 d起,對(duì)照組可滴定酸含量迅速下降,貯藏至第7 d,凍干粉處理組可滴定酸含量為0.17%,是對(duì)照組的1.3倍。表明該生防菌劑能通過(guò)抑制病原菌對(duì)果實(shí)的侵染和營(yíng)養(yǎng)消耗,減少機(jī)體的氧化損傷,進(jìn)而延遲后熟作用引起的呼吸底物消耗,減緩可滴定酸含量的降低。

2.5.7 不同處理下水蜜桃果皮相對(duì)電導(dǎo)率的變化 相對(duì)電導(dǎo)率是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo),能夠反映菌粉制劑對(duì)水蜜桃果皮細(xì)胞膜的保護(hù)能力。從圖11可以看出,各處理組水蜜桃果皮的相對(duì)電導(dǎo)率均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。貯藏至第4 d時(shí),對(duì)照組水蜜桃果皮的相對(duì)電導(dǎo)率就上升至54.39%,顯著高于(P<0.05)凍干粉處理組的相對(duì)電導(dǎo)率47.53%。在整個(gè)貯藏期間,凍干粉處理組相對(duì)電導(dǎo)率一直低于其他處理組。說(shuō)明該生防菌劑能誘導(dǎo)宿主抗氧化性能的提高,對(duì)水蜜桃果皮細(xì)胞膜系統(tǒng)具有很好的保護(hù)效果,能夠減緩采后果實(shí)衰老和腐爛速度。

圖11 不同處理下水蜜桃果皮相對(duì)電導(dǎo)率的變化Fig.11 Changes in the relative conductivity ofhoney peach under different treatments

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)間型假絲酵母菌Y-17活性?xún)龈煞郾Ｗo(hù)劑進(jìn)行篩選和優(yōu)化,得到其最佳配方為:山梨醇5.43 g/100 mL、海藻糖12.45 g/100 mL、谷氨酸鈉13.56 g/100 mL,酵母存活率可達(dá)84.21%±0.87%,且所制備的凍干粉仍具有較高的生防效力,其最佳貯藏溫度為-20 ℃。之后,通過(guò)對(duì)不同處理?xiàng)l件下水蜜桃生理指標(biāo)的分析,結(jié)果表明,上述制備的活性?xún)龈煞勰茱@著降低水蜜桃貯藏期間的發(fā)病率(P<0.05),減少水分的流失,對(duì)果實(shí)的硬度、VC含量、TSS含量、可滴定酸含量、果皮細(xì)胞膜的完整性均有一定的維持作用。綜上,本實(shí)驗(yàn)利用間型假絲酵母Y-17制備的活性?xún)龈煞蹖?duì)水蜜桃采后的貯藏具有良好的保鮮效果,為今后間型假絲酵母Y-17在桃褐腐病生物防治方面的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。