響應面法優化糞腸球菌包被發酵培養基

郭建軍,熊大維,曾 靜,魏國汶,袁 林

(江西省科學院微生物研究所,江西南昌 330096)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)作為能在腸道黏附生長的乳酸菌[1],具有良好的生物安全性和優良的益生特性[2]。在腸內能抵抗低pH環境,比一些腸道“過路菌”有更強的排斥和競爭致病菌的定植[3],還可通過分泌細菌素等抗菌物質抑制致病菌[4],同時糞腸球菌可代謝產生對養殖動物有益的營養物質,如L-乳酸、氨基酸、維生素及酶,提高胃腸內營養水平[5],促進動物生長,提高飼料轉化率[6]。糞腸球菌已逐步發展成為最具有應用前景的抗生素替代品[7-8]。但糞腸球菌的應用效果受多種因素的影響[9],如生理狀態、飼喂方法、溫度和菌制劑的保存時間等都極易使菌失活,喪失益生特性[7]。通過微膠囊技術包被益生菌[10],可有效增強微生物對高溫、胃酸及膽汁等不良環境因子的抵抗能力,提高產品的穩定性[11],保護菌體細胞少受剪切力的影響,進而增強益生菌的益生作用[12]。

目前,針對微生物細胞的包被技術多為發酵后包被[13],存在微膠囊產品得率低、活菌保存量少、能耗和成本較高等問題[14],產品活菌含量較低、且粒徑大小不均一,從而造成微膠囊產品包被效果不佳[15-16]。發酵前包被將微生物活菌包被于微膠囊內,能夠使糞腸球菌在微膠囊微環境下大量增殖,保護細胞少受剪切力的影響,從而實現其高密度和高活性的目的[17]。王婷婷等[18]在發酵前進行包被,得到顆粒大小均勻、球形度好、大小均勻的微囊化屎腸球菌固態產品,明顯提高了屎腸球菌在極端環境下的存活率,有效地防止了菌體失活[18]。閆穎娟等[19]采用響應曲面法對微囊化保加利亞乳桿菌高密度培養的培養基組成和培養條件進行優化,其細胞菌密度可達到3.18×1011CFU/g。張琳等[20]對糞腸球菌進行發酵前包被制備糞腸球菌膠囊,顯著增強了其對高溫環境的耐受性,延長產品貨架期。有關糞腸球菌包被培養基的優化研究仍較少。

本研究以糞腸球菌為對象,以海藻酸鈉-碳酸鈣微膠囊體[20]進行包被,采用中心組合設計和響應面對其包被發酵培養基組成分和含量進行了優化,確定適宜糞腸球菌高密度包被培養的發酵培養基,以期為工業化生產優質的糞腸球菌微生態制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糞腸球菌EXW27 由江西省科學院微生物研究所南昌市應用微生物重點實驗室從健康仔豬腸道黏膜上分離純化的優勢菌株[21],體外試驗證明,該菌株對于畜禽具有優良的益生潛力;SYTO 9 綠色熒光核酸染料 美國英杰生命技術公司;酵母粉、蛋白胨、牛肉膏 安琪酵母股份有限公司;吐溫80 生工生物工程(上海)股份有限公司;葡萄糖、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、磷酸氫二鉀 國藥集團化學試劑有限公司;硫酸鎂、硫酸錳 西隴化工股份有限公司;納米碳酸鈣 江西永發化工公司;海藻酸鈉 青島明月海藻集團有限公司;其他試劑均為國產分析純。

SW-CJ-ID型單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;LDZX-50KBS立升手輪型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安儀表有限公司;SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司;L204電子天平、pH計FE20 梅特勒-托利多儀器(上海)股份有限公司;5 L發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司;H2500R臺式高速大容量冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;Scientz-10N臺式真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;BX43生物顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備 MRS 培養基(g/L):胰蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、檸檬酸銨2.0 g、K2HPO4·7H2O 2.0 g、NaAc·3H2O 4.0 g,Tween 80 1.0 mL、MgSO4·7H2O 0.60 g、MnSO4·H2O 0.25 g,將上述成分加入到1000 mL 蒸餾水中,加熱溶解,調節pH為6.2,121 ℃滅菌15 min,需要時加入15 g 瓊脂,用于活化菌種和種子培養以及活菌含量檢測。包被發酵培養基:在MRS培養基上添加海藻酸鈉 10 g、納米碳酸鈣20 g。

1.2.2 液體種子培養 將本實驗室保存的菌種糞腸球菌EXW27在培養基上劃線接種至斜面MRS培養基上活化,37 ℃恒溫培養24 h,傳代兩次。從保藏斜面挑一環菌苔接于裝有100 mL液體MRS培養基的250 mL三角瓶中,于37 ℃、120 r/min培養12 h。

1.2.3 包被發酵培養 將菌株種子液按3%(V/V)接種于裝液量為70%的5 L小罐基礎包被發酵培養基中,初始pH7.0,攪拌轉速100 r/min,不通氣,控制發酵溫度37 ℃至發酵結束。

1.2.4 菌體形態觀察 用活細胞核酸染色劑(SYTO9)對發酵培養的糞腸球菌進行染色,在熒光顯微鏡下通過顏色不同判斷細胞的活力狀態。

1.2.5 包被培養糞腸球菌培養基配方的優化

1.2.5.1 Plackett-Burman試驗設計 根據前期單因素實驗結果,選取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、檸檬酸銨、K2HPO4·7H2O、NaAc·3H2O,Tween 80、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、海藻酸鈉、納米碳酸鈣等12個對包被培養活菌含量影響較大的因素,通過Design Expert 8.0 軟件進行N=16的Plackett-Burman試驗設計(見表1),以包被培養活菌含量(R)作為響應值進行試驗分析,從中篩選出對包被培養活菌含量影響顯著的培養基組分。

表1 二水平部分因子設計的因素和水平Table 1 Factors and levels of two-level partial factorial design

1.2.5.2 最陡爬坡試驗 根據Plackett-Burman試驗得出的擬合方程中各顯著性因素對響應值的影響,以實驗值變化梯度方向為爬坡方向,根據各因素效應值大小確定變化步長,設計最陡爬坡試驗(表5),快速逼近包被培養活菌含量最大區域。

1.2.5.3 響應面試驗 對Plackett-Burman試驗確定的因素,以最陡爬坡試驗得到的中心點,運用Box-Behnken的中心組合設計原理,設計了3因素5水平共20個實驗點進行響應面試驗,因素水平表見表2。

表2 中心組合試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Central Composite Design

1.2.5.4 驗證試驗 將菌株種子液按3%(V/V)接種于裝液量為70%的5 L發酵罐微囊包被培養最適培養基中,初始pH6.5,攪拌轉速100 r/min,不通氣,37 ℃培養,每隔1 h取樣。每次取樣測其活菌濃度、發酵液pH,并以培養時間為橫坐標,繪制菌株生長曲線。

1.2.6 微膠包被活菌數的測定 將樣品加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH6.2)中攪拌30 min,使微囊包被的糞腸球菌破壁后進行活菌計數;用梯度稀釋法稀釋一定倍數后,取3個濃度梯度進行MRS培養基傾注平板,每個梯度設3個平行,37 ℃培養48 h計數,結果以CFU/mL或CFU/g表示。

1.2.7 包被培養糞腸球菌的貯存耐受性試驗 將菌液8000×g離心15 min,棄去上清液,收集菌泥;離心所得的菌泥與含3%脫脂奶粉的0.2 mol/L檸檬酸溶液等質量混合均勻,置于-40 ℃預凍處理5 h以上,在冷凝溫度<-60 ℃、真空度<15 Pa下冷凍干燥[22]。包被培養和游離培養的糞腸球菌凍干粉在37 ℃條件下貯存,分別于0、10、30、60、90 d取樣,每個處理3個重復。采用平板計數法計算每克產品的活菌數,按照公式(1)計算不同培養方式下糞腸球菌凍干粉在貯存不同時間的存活率。

存活率(%)=(貯存不同時間后凍干粉活菌數/初始活菌數)×100

式(1)

1.3 數據處理

實驗所用到的數據分析軟件為Design Expert 8.0.6b及SPSS Statistics 17.0。

2 結果與分析

2.1 包被培養和未包被培養的糞腸球菌形態的比較

游離培養和包被培養的糞腸球菌鏡檢結果如圖1所示。以MRS培養基培養的糞腸球菌EXW27細胞呈短鏈狀,均勻分散游離在發酵液中,不聚團(圖1A),以發酵培養基培養的糞腸球菌EXW27細胞聚集成團的形成微膠囊,囊內菌體密度較大,未出現破囊現象,菌體也沒有明顯泄漏,且所形成的微囊大小較均勻,成球形良好,界限明顯(圖1B)。這是因為,在含納米碳酸鈣和海藻酸鈉的發酵培養基中,隨著糞腸球菌的不斷生長繁殖,產生了大量酸性代謝產物(如乳酸),被納米碳酸鈣中和并釋放Ca2+,當Ca2+向周圍擴散形成以海藻酸鈣為主要成分凝膠薄膜,包裹于四周逐漸形成中空的球狀微囊,糞腸球菌被固定在微囊之中,從而形成微囊包被培養糞腸球菌。以上結果說明,加入納米碳酸鈣和海藻酸鈣后可以實現對糞腸球菌進行包被培養。

圖1 游離培養和包被培養的糞腸球菌鏡檢結果(×100)Fig.1 Microscopy results of Enterococcus faecalisin free and encapsulated cultures(×100)注:A:在MRS培養基中游離培養的糞腸球菌;B:在發酵培養基中包被培養的糞腸球菌。

2.2 Plackett-Burman試驗及其結果分析

表3 Plackett-Burman試驗設計和結果Table 3 Experimental design and response of Plackett-Burman

表4 Plackett-Burman試驗方差分析Table 4 ANOVA for the Plackett-Burman design

注:“*”表示對結果影響顯著(P<0.05)。2.3 最陡爬坡試驗結果

由表5可知,隨著葡萄糖、海藻酸鈉和納米碳酸鈣3個主要影響因素的變化,微囊包被活菌含量呈現先上升后下降的趨勢,其中第4組培養基對應的微囊包被活菌含量達到了最大值,達到57.825×108CFU/mL,相應變量接近最大響應區域,所以選取第4組條件即葡萄糖 5.0%、海藻酸鈉1.6%和納米碳酸鈣3.2%為中心點進行響應面試驗。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Experimental design of steepestascent and corresponding results

2.4 響應面試驗結果

通過最陡爬坡試驗確定了主要影響因素的具體濃度的取值區間,以葡萄糖(X1)、海藻酸鈉(X2)、納米碳酸鈣(X3)3個因素為自變量,糞腸球菌微囊包被培養活菌含量(R)為響應值,通過Design-expert 軟件設計3因素5水平的中心組合設計試驗,試驗設計和結果如表6所示。

表7 響應面試驗方差分析結果Table 7 Results of variance analysis of response surface experiments

注:*表示差異顯著,P<0.05:**表示差異極顯著,P<0.01。

表6 中心組合試驗設計及結果Table 6 Design and results of central composite experiment

固定其中的一個因素,做另外兩個因素交互作用的曲面圖及等高線圖,確定葡萄糖濃度、海藻酸鈉濃度和納米碳酸鈣交互作用對菌株發酵培養活菌數含量的影響,結果如圖2。由圖2可知,葡萄糖、海藻酸鈉和納米碳酸鈣兩兩交互作用的等高線圖均呈橢圓形,說明其交互作用均顯著。響應面圖均為拋物面,都存在一個極大值點,只有在各因素濃度適宜的條件下,培養后糞腸球菌微囊包被培養的活菌含量才會達到最大值。

圖2 各因素交互作用對糞腸球菌微囊包被培養的活菌含量影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plot and contour line ofinteractive effects of various factors onenveloped Enterococcus faecalis concentration

2.5 驗證試驗

如圖2所示,響應面拋物線圖形開口均向下,說明存在最大值,即響應面覆蓋了最大值所在的區域。對回歸方程求解最大值可得:當X1=-0.071、X2=0.897、X3=0.945,即葡萄糖為4.93%、海藻酸鈉為1.87%、納米碳酸鈣為3.65%。由此可知,最適培養基組成為:葡萄糖4.93%、蛋白胨1%、牛肉膏0.8%、酵母粉0.3%、檸檬酸銨0.3%、K2HPO4·7H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.06%、MnSO4·H2O 0.045%、NaAc·3H2O 0.6%、吐溫80 0.1%、海藻酸鈉 1.87%、納米碳酸鈣 3.65%。在此條件下,糞腸球菌微囊包被培養的預測活菌含量最大,為6.56×109CFU/mL。

最適培養基條件下菌株的生長曲線如圖3所示。由圖3可知,優化后培養基在包被培養過程中pH緩慢下降,下降速率顯著低于優化前(P<0.05),培養20 h后pH仍保持在5.8以上,為糞腸球菌包被培養提供較穩定的pH環境;包被培養的糞腸球菌優化后培養基比優化前提前2 h進入對數生長期,且對數生長期菌體的生長速率明顯高于優化前,在11 h時包被培養的活菌含量最高為6.83×109CFU/mL,與預測值誤差僅4.12%,說明該模型能很好地模擬和預測實驗結果,證實了模型的有效性。

圖3 包被培養的糞腸球菌的生長曲線Fig.3 Growth curve of Enterococcus faecalisin encapsulated culture

2.6 包被培養的糞腸球菌凍干粉的貯存穩定性

由圖4可知,游離培養得到的糞腸球菌凍干粉在37 ℃條件下貯存,活菌數急速下降,在10 d存活率降至1.2%;而包被培養得到的糞腸球菌凍干粉在37 ℃條件下貯存10 d內活菌數沒有明顯下降,90 d后存活率為82.3%,說明包被發酵糞腸球菌凍干粉具有很好的穩定性和較長的貨架期,這為今后糞腸球菌包被發酵的工業化生產及推廣應用提供了依據。

圖4 凍干菌粉在37 ℃條件下的貯存試驗Fig.4 Results of freeze-dried bacteriapowder accelerated storage test at 37 ℃

3 結論

形態觀察結果表明,在含納米碳酸鈣和海藻酸鈉的發酵培養基中,隨著糞腸球菌繁殖產生的酸性代謝產物與納米碳酸鈣和海藻酸鈉反應,形成以海藻酸鈣為主的凝膠薄膜將糞腸球菌固定在微囊之中,囊內充滿大量菌體細胞聚集成團,微囊大小較均勻,成球形良好,界限明顯。通過Plackett-Burman 試驗設計篩選出葡萄糖、海藻酸鈉和納米碳酸鈣 3 個對糞腸球菌包被培養活菌含量影響顯著(P<0.05)。進一步優化得到的包被發酵培養基最佳組成為:葡萄糖4.93%、海藻酸鈉1.87%、納米碳酸鈣3.65%。對包被培養優化后培養基進行了驗證試驗,整個培養過程中pH維持在5.8以上,包被培養的糞腸球菌活菌達6.83×109CFU/mL,與預測值誤差僅4.12%,是優化前的2.88倍。在糞腸球菌凍干粉的貯存穩定性試驗中發現,包被培養的糞腸球菌凍干粉在37 ℃條件下貯存10 d內活菌數沒有明顯的下降,90 d后活菌仍保留80%以上的存活率,說明包被培養糞腸球菌凍干粉具有較高的穩定性和較長的貨架期,為糞腸球菌微生態制劑產品的開發提供理論依據。