一株產細菌素植物乳桿菌高密度發酵培養基的篩選及其在酸奶中的應用

賀 菁,周金雨,劉瑞娜,梁 玉,侯雨佳,孟祥晨

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

植物乳桿菌是一類革蘭氏陽性乳桿菌屬,是國內外公認的食品加工用微生物菌種,已被廣泛用作發酵劑[1],在許多發酵食品中起重要作用。植物乳桿菌除了在發酵過程中能產生各種代謝產物影響發酵食品的香氣、風味、顏色和質地等[2-4],還可以產生諸如有機酸、雙乙酰、過氧化氫、二氧化碳、脂肪酸、乙醇和細菌素等抗菌物質,有效抑制食品腐敗和病原微生物的生長[5-6]。植物乳桿菌還具有維持腸道內菌群平衡、預防各種腸道疾病和改善免疫功能等益生特性[7],對人體健康具有積極作用。

本研究團隊前期較為系統地研究了植物乳桿菌KLDS 1.0391產細菌素特性[8],該菌還具有一定的益生特性,能夠在一些食品中作為生防菌種使用[9]。生防菌種制備的第一個關鍵環節就是高密度發酵,為了獲得高濃度植物乳桿菌菌體密度,有必要優化其工業化發酵生產用培養基。

理想的高密度發酵培養基應有如下特點:使菌體在較短時間內獲得較高的濃度;發酵液中的微生物與培養基分離較容易;緩沖能力較好;培養基成分價格較低且易得。天然食物基質由于營養物質豐富,是培養基的首選,尤其是生產某些食品時產生的廢棄物,用其做培養基既可滿足微生物生產需求,又解決了廢棄物污染環境的問題。常用的用作培養基的物質包括:麥芽汁、果蔬汁、玉米漿以及蛋白水解物等。Rivas等[10]以玉米漿等為原料,開發了一種廉價的鼠李糖乳桿菌發酵培養基;Li等[11]以麥麩為培養基氮源,降低了菊糖芽孢乳桿菌發酵生產乳酸的成本;Sato等[12]發現大豆分離蛋白、牛乳清蛋白和蛋清蛋白水解物有促進嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌增殖的作用。上述研究表明脫脂乳粉、乳清、麥麩、玉米漿粉等天然物質有潛力用于高密度發酵植物乳桿菌。

本研究的主要目的是以植物乳桿菌KLDS 1.0391為對象,優化可用于其高密度發酵的價格低廉的天然培養基,研究植物乳桿菌直投式菌種對酸奶品質的影響,以期獲得具有益生作用的酸奶輔助發酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌KLDS 1.0391 乳品科學教育部重點實驗室(東北農業大學);枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC6633 中國藥品生物制品檢定所;植物乳桿菌P83 法國普爾斯有限公司;中性蛋白酶(100000 U/g) 北京索來寶科技有限公司;乳清粉 芬蘭維利奧公司有限公司;玉米漿粉 山東省濟寧市雙華工貿有限公司;麥麩 山東省菏澤市黃河灘農戶人家;脫脂乳粉 南京益生源生物科技有限公司;酸奶發酵劑 法國普爾斯有限公司;牛奶 市售;MRS培養基:蛋白胨5.0 g,牛肉膏5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,Tween-80 1.0 g,葡萄糖20.0 g,硫酸錳0.25 g,乙酸鈉5.0 g,檸檬酸氫二銨2.0 g,硫酸鎂0.58 g,磷酸氫二鉀2.0 g,蒸餾水1 L;營養肉湯培養基:蛋白胨10.0 g,牛肉膏5.0 g,NaCl 5.0 g,蒸餾水1 L;其它藥品均為分析純或者生化純。

KRH-3000發酵罐 江蘇科海生物工程設備有限公司;BCN1360型生物潔凈工作臺 上海佳勝實驗設備有限公司;SPX-150B生化培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司;GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所;LGJ-1冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化與培養 將-80 ℃冰箱中冷凍保存的植物乳桿菌KLDS 1.0391和枯草芽孢桿菌ATCC 6633,以2%接種量分別接種于MRS培養基和營養肉湯培養基中,于37 ℃培養16 h,連續活化傳代3次備用。

1.2.2 10 L發酵罐的發酵工藝 在前期實驗的基礎上,優化出10 L發酵罐的發酵工藝如下,裝罐量6 L,按照3%接菌量分別接種植物乳桿菌KLDS 1.0391,發酵溫度37 ℃,發酵pH6.0,脫脂乳粉、乳清粉、麥麩及玉米漿粉培養基的發酵時間分別為20、40、24、11 h。

1.2.3 脫脂乳、乳清和麥麩酶水解物的制備 參照文獻方法[13]分別將脫脂乳粉、乳清粉和麥麩配制成4%(w/v)的溶液,調節pH至7.0,添加中性蛋白酶,于40 ℃恒溫水解,水解過程中通過加入氫氧化鈉溶液使pH恒定在7.0。根據pH-stat法[14]分別檢測脫脂乳、乳清和麥麩溶液的水解度,至水解度達到0%、5%、10%、15%、20%、25%,添加2%葡萄糖和0.1% Tween-80,制備成不同水解度的脫脂乳、乳清和麥麩培養基。

1.2.4 脫脂乳、乳清和麥麩培養基的高密度發酵 上述0%、5%、10%、15%、20%、25%水解度的脫脂乳、乳清和麥麩培養基,分別接種3%的植物乳桿菌KLDS 1.0391培養液,采用10 L發酵罐發酵,發酵時間分別為20、40、24 h,發酵結束后取發酵液,測定植物乳桿菌的活菌數量和抑菌效果。

1.2.5 最佳高密度發酵培養基的確定 參照文獻[13]將玉米漿粉配制成4%(w/v)的溶液,添加2%葡萄糖(補充碳源)和0.1% Tween-80(具有促進細菌素合成的作用),制備成玉米漿粉培養基。分別以15%水解度的脫脂乳培養基、15%水解度的乳清培養基、20%水解度的麥麩培養基以及上述玉米漿粉培養基作為發酵培養基,采用1.2.2的工藝參數發酵植物乳桿菌KLDS 1.0391,以活菌數和抑菌效果為指標篩選植物乳桿菌KLDS 1.0391的最佳高密度發酵培養基。

1.2.6 植物乳桿菌直投式菌種的制備 植物乳桿菌KLDS 1.0391以玉米漿粉為培養基時,參照文獻方法[15]得到最佳發酵工藝參數為:發酵溫度34.7 ℃,發酵恒pH6.2,接種量3.1%;凍干保護劑為:11.3%的脫脂乳,9.8%的蔗糖,5.1%的谷氨酸鈉,0.2%的Tween-80;預凍條件為:初始菌濃度1011CFU/mL、預凍溫度-80 ℃、預凍時間8 h,采用上述參數制備出凍干形式的植物乳桿菌直投式菌種的活菌數為11.29 lg CFU/g。

表1 試驗組別Table 1 Test group

表2 酸奶樣品感官評價評分標準和評分指標Table 2 Sensory description and evaluation indexes for the yogurt

1.2.7 酸奶的制作工藝 將牛奶預熱至65 ℃,加入6.5%蔗糖混勻,然后于95 ℃滅菌5 min,待冷卻至42 ℃時按表1的試驗組別接種酸奶發酵劑、植物乳桿菌P83和植物乳桿菌KLDS 1.0391,接種完成后于43 ℃發酵(以pH4.6為發酵終點),發酵結束后于4 ℃后熟24 h制成成品酸奶。

1.2.8 指標的測定

1.2.8.1 活菌數量的測定 采用平板菌落計數法[16]測定活菌數量,取1 mL發酵液用9 mL無菌生理鹽水稀釋至合適倍數后,涂布于MRS瓊脂培養基,37 ℃培養48 h后計數。

1.2.8.2 抑菌活性的測定 參照文獻方法[17],取10 mL發酵液經12000 r/min離心15 min,收集無細胞發酵上清液,采用雙層平板打孔法測定抑菌活性,具體操作如下:按每平皿10 mL將1.2%的瓊脂傾倒于無菌平皿中晾干;以0.6%的接種量將枯草芽孢桿菌接入含0.7%瓊脂的營養肉湯培養基中,傾倒6 mL含有枯草芽孢桿菌的營養肉湯瓊脂培養基于底層瓊脂上;晾干后用打孔器打孔,向孔中加入100 μL無細胞發酵上清液,在生物潔凈工作臺中擴散3 h后,置于適宜條件下培養后用游標卡尺測定抑菌圈直徑。

1.2.8.3 發酵終點的測定 當樣品的pH達到4.6時,即可停止發酵,測定1.2.6表1中四個試驗組到達發酵終點的時間。

1.2.8.4 pH和滴定酸度的測定 將酸奶分別置于4 ℃儲藏14 d和25 ℃儲藏7 d,參照文獻方法[9]測定pH和滴定酸度。

1.2.8.5 黏度的測定 將酸奶分別置于4 ℃儲藏14 d和25 ℃儲藏7 d,采用Brookfiled DV-Ⅱ+Pro黏度計測定酸奶的黏度。

1.2.8.6 感官評價 選擇3名男性和9名女性共12人,年齡在22～32歲,進行感官評價,分別從質地、香氣、流動性、色澤、口感和風味六個方面進行評價。評分標準如表2所示。

1.3 數據處理

所有試驗均獨立重復三次,采用SPSS 20.0進行數據處理及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同水解度的脫脂乳培養基對植物乳桿菌生長和細菌素合成的影響

脫脂乳培養基的水解度對植物乳桿菌KLDS 1.0391的生長和產細菌素能力影響顯著(見圖1);當水解度為0%～15%時,活菌數和抑菌圈直徑均隨水解度提高呈上升趨勢;之后隨水解度提高呈下降趨勢;當水解度為15%時,活菌數最大,達到9.39 lg CFU/mL,抑菌圈直徑也最大,達到12.28 mm,確定脫脂乳培養基的最佳水解度為15%。

圖1 不同水解度的脫脂乳培養基對植物乳桿菌生長和細菌素合成的影響Fig.1 Effect of medium with different hydrolysis degrees ofskimmed milk on growth and bacteriocin synthesis ofLactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.2 不同水解度的乳清培養基對植物乳桿菌生長和細菌素合成的影響

當乳清培養基的水解度為0～15%時,植物乳桿菌KLDS 1.0391的活菌數和抑菌圈直徑隨水解度提高呈上升趨勢,之后隨水解度增加開始呈下降趨勢;當水解度為15%時,活菌數量達最大值(9.01 lg CFU/mL),抑菌圈直徑達12.66 mm,也為最大值(見圖2)。確定乳清培養基的最佳水解度為15%。

圖2 不同水解度的乳清培養基對植物乳桿菌生長和細菌素合成的影響Fig.2 Effect of medium with different hydrolysis degrees ofwhey on growth and bacteriocin synthesis ofLactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.3 不同水解度的麥麩培養基對植物乳桿菌生長和細菌素合成的影響

麥麩培養基的水解度顯著影響植物乳桿菌KLDS 1.0391的生長和產細菌素能力(見圖3),當麥麩培養基的水解度為0%～20%時,植物乳桿菌KLDS 1.0391的活菌數和抑菌圈直徑隨水解度提高呈逐漸上升趨勢,之后隨水解度提高開始呈下降趨勢;當水解度為20%時,活菌數最大,達到9.41 lg CFU/mL,抑菌圈直徑也最大,達到12.09 mm。確定麥麩培養基的最佳水解度為20%。

圖3 不同水解度的麥麩培養基對植物乳桿菌生長和細菌素合成的影響Fig.3 Effect of medium with different hydrolysis degrees ofwheat bran on growth and bacteriocin synthesis ofLactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.4 比較四種培養基對菌株生長及細菌素合成的影響

由圖4可知,植物乳桿菌KLDS 1.0391在最佳水解度的脫脂乳、乳清、麥麩及玉米漿粉四種培養基中發酵結束時,所獲得的活菌數由大到小依次為:玉米漿粉培養基>20%水解度的麥麩培養基>15%水解度的脫脂乳培養基>15%水解度的乳清培養基;所獲得的抑菌效果由大到小依次為:玉米漿粉培養基>15%水解度的乳清培養基>15%水解度的脫脂乳培養基>20%水解度的麥麩培養基;植物乳桿菌KLDS 1.0391在玉米漿粉培養基發酵結束時,活菌數達到最大值(9.53 lg CFU/mL),相比15%水解度的乳清培養基活菌數提高了5.7%;抑菌圈直徑也達到最大值(12.69 mm),相比20%水解度的麥麩培養基抑菌活性提高了5.2%。上述結果說明植物乳桿菌KLDS 1.0391在玉米漿粉培養基中菌體生成量和細菌素合成量最佳,玉米漿粉培養基(成分為4%玉米漿粉、2%葡萄糖和0.1% Tween-80)可以作為其高密度發酵廉價培養基。

圖4 四種培養基對植物乳桿菌生長和細菌素合成的影響Fig.4 Effect of four different mediumson growth and bacteriocin synthesis ofLactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.5 植物乳桿菌直投式發酵劑在酸奶中的應用

2.5.1 植物乳桿菌直投式菌種對酸奶發酵時間、pH和滴定酸度的影響 所有樣品均在4.5～6 h到達發酵終點(見圖5),由于添加植物乳桿菌P83,陽性對照組發酵時間較空白對照組延長,且本實驗所制備的菌種的發酵時間相比陽性對照組也延長,但這種影響在所有的組別中無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 四組試驗達到發酵終點所用的時間Fig.5 The time for four groups of experimentsto reach the end of fermentation

由圖6可知,酸奶在4 ℃貯藏時,陽性對照組pH下降最為緩慢,其次是試驗組2、試驗組1,而空白對照組的pH下降最為迅速。當貯藏溫度為25 ℃時,四組試驗的pH仍然保持了4 ℃時的變化趨勢,但pH比4 ℃時低。上述結果說明在4 ℃冷藏條件下,由于植物乳桿菌KLDS 1.0391直投式菌種的添加,在一定程度上減緩了酸奶后酸化程度,在25 ℃下,這種作用效果則不明顯(P>0.05)。

圖6 直投式菌種對酸奶儲藏過程中pH的影響Fig.6 Effect of direct-in-vat strainson pH of yogurt during storage

由圖7可知,酸奶在4 ℃貯藏時,空白對照組酸度上升最高,其次是陽性對照組,而添加植物乳桿菌制備的酸奶滴定酸度上升的最小。在25 ℃貯藏時,陽性對照組滴定酸度上升的最小,空白對照組和本實驗菌株制備的實驗組滴定酸度差異不顯著(P>0.05)。上述結果說明在4 ℃冷藏條件下,植物乳桿菌KLDS 1.0391直投式菌種對酸奶滴定酸度的升高有較好的抑制作用,在25 ℃下,則對酸奶滴定酸度的升高無明顯的抑制作用(P>0.05)。

圖7 直投式菌種對酸奶儲藏過程中滴定酸度的影響Fig.7 Effect of direct-in-vat strainson titratable acidity of yogurt during storage

2.5.2 植物乳桿菌直投式菌種對酸奶黏度的影響 酸奶在4 ℃和25 ℃貯藏時,空白對照組的粘度高于其它組,其次是陽性對照組和本研究制備的直投式菌種組(見圖8),上述結果說明由于添加植物乳桿菌,導致酸奶粘度下降。

圖8 直投式菌種對酸奶儲藏過程中黏度的影響Fig.8 Effect of direct-in-vat strainson viscosity of yogurt during storage

2.5.3 植物乳桿菌直投式菌種對酸奶感官評價的影響 從質地、香氣、流動性、色澤、口感和風味六個方面對4 ℃貯藏的酸奶進行感官評價(見表3)。儲藏時間為0、1、2、5、8 d時,試驗組1、試驗組2與對照組差異不顯著(P>0.05),說明加入植物乳桿菌沒有對酸奶的感官評價產生很大的影響。

3 討論與結論

本研究用不同水解度的脫脂乳、乳清、麥麩和玉米漿粉制備植物乳桿菌KLDS 1.0391高密度發酵培養基,最終從中篩選出比酵母粉、蛋白胨等價格更為低廉的玉米漿粉為培養基,成分為4%玉米漿粉、2%葡萄糖和0.1% Tween-80。采用上述玉米漿粉培養基發酵植物乳桿菌KLDS 1.0391,活菌數達到9.53 lg CFU/mL,抑菌圈直徑達到12.69 mm,優于已報道[18]的采用MRS培養基發酵植物乳桿菌KLDS 1.0391獲得的水平(活菌數達9.21 lg CFU/mL,抑菌圈直徑達11.41 mm)。目前針對植物乳桿菌的發酵培養基成分普遍比較復雜,獲得的活菌數差異較大,白玉柱等[19]以玉米漿粉為氮源優化MRS培養基組成成分,最終使植物乳桿菌HEW-A401活菌數達到8.77 lg CFU/mL。而劉香英等[20]優化了植物乳桿菌K25高密度發酵培養基,活菌數可達10.71 lg CFU/mL。本研究優化獲得的培養基,可使植物乳桿菌KLDS 1.0391活菌數達9.53 lg CFU/mL,還具有價格低廉、處理方便的優勢,作為工業化發酵生產用培養基有極大的可行性。

表3 4 ℃儲藏過程中酸奶感官評價Table 3 The results of sensory evaluation of yogurt during storage at 4 ℃

注:同行數據字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。具有良好的耐酸耐膽鹽特性,并且在細胞黏附、降膽固醇、免疫活性等方面表現出一定的益生特性[21],本實驗將植物乳桿菌KLDS 1.0391作為益生輔助發酵劑應用于酸奶,不僅可以緩解酸奶后酸化程度,也可以提高酸奶的營養價值和益生作用,因此本實驗得到的植物乳桿菌直投式菌種作為具有益生作用的酸奶輔助發酵劑具有一定的潛力。