一月齡嬰兒糞便菌群對五種非消化糖的體外發酵作用

梁 玉,趙鵬昊,尚佳萃,劉瑞娜,賀 菁,侯雨佳,孟祥晨

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

嬰兒時期為腸道菌群定植的關鍵窗口時期,腸道菌群對嬰兒早期免疫系統、消化系統的發育及成年后機體的生理狀況均有深遠的影響。腸道菌群的生態失調與各種疾病相關,包括肥胖、高血壓、心血管疾病、糖尿病、癌癥、炎癥性腸病、痛風、抑郁癥等[1]。

膳食中的非消化糖不會被消化酶分解,因此非消化糖可通過胃和小腸并最終作為腸道菌群發酵的底物,生成促進機體健康的代謝產物,并形成腸道特定的微環境[2]。腸道菌群可合成多種碳水化合物降解酶,因此腸道菌群能較好地利用非消化糖[3]。

腸道菌群依靠非消化糖提供能量來源,同時,非消化糖的攝入是腸道菌群生態、多樣性和功能的關鍵決定因素[4]。Peril等[5]研究低聚半乳糖對腸道菌群的影響,研究發現低聚半乳糖可增加糞便菌群中雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的相對豐度。Andenplas等[6]研究添加低聚果糖和低聚半乳糖的嬰幼兒配方奶粉對嬰幼兒腸道菌群的影響,結果表明非消化糖的加入均可軟化糞便、降低糞便pH、提高管腔滲透水結合能力和提高嬰幼兒糞便中短鏈脂肪酸的含量。Oliveira等[7]研究發現,在低脂牛奶中添加菊粉,可促進食用者腸道菌群中嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌的生長。國內外學者的研究多集中于月齡較大的嬰幼兒及成人對非消化糖的發酵作用,而對于一月齡嬰兒糞便菌群對非消化糖的發酵作用的對比還未見報道。

本研究的主要目的是解析一月齡嬰兒糞便對低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、聚葡萄糖五種非消化糖的發酵作用,通過體外發酵方式揭示并對比各種非消化糖與嬰兒腸道菌群間的互作,對一月齡嬰兒膳食中非消化糖的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低聚果糖(純度≥95%)、低聚半乳糖(純度≥98%)、低聚木糖(純度≥95%)、菊粉(純度≥99%)、聚葡萄糖(純度≥99%) 上海源葉生物科技有限公司;乳酸、乙酸、丙酸及丁酸標準品(色譜純) 天津市科密歐化學試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、SuperReal PreMix Plus、質粒小提試劑盒 北京天根生化科技有限公司;pMD 19-T simple vector 大連寶生物工程有限公司;其他試劑 均為分析純。

Waters 2695型高效液相色譜儀(配有可變波長紫外檢測器和色譜工作站) 美國Waters公司;BCN1360型生物潔凈工作臺 上海佳勝實驗設備有限公司公司;1029型厭氧培養箱 Thermo Fisher Scientific;DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;GL-21 M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所;HVE-8D型全自動高壓滅菌鍋 日本HIRAYAMA;AF100型制冰機 SCOTSMAN公司;DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠;微量臺式離心機 Microfuge20R,美國Beckman公司;StepOnePlus實時熒光定量PCR儀 美國應用生物系統公司;NanoDrop 1000超微量分光光度計 美國 Nanodrop公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外發酵培養基的配制 根據Yan等[8]體外發酵培養方法配制基礎培養基,培養為蛋白胨2.0 g/L、酵母提取物2.0 g/L、NaCl 0.1 g/L、K2HPO40.04 g/L、MgSO40.01 g/L、CaCl20.01 g/L、NaHCO32.0 g/L、血紅素0.02 g/L、半胱胺鹽酸鹽0.5 g/L、膽鹽0.5 g/L、刃天青1.0 mg/L、吐溫80 2.0 mL/L、維生素K 10 μL/L。分別稱取50 mg低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、聚葡萄糖做培養基中唯一碳源,加入到含4.5 mL基礎培養基的10 mL西林瓶中;空白對照不加入任何碳源,于121 ℃、高壓滅菌15 min備用。

1.2.2 糞便菌懸液的配制 選擇3位無胃腸道疾病及抗生素治療史的一月齡健康嬰兒為受試者。收集受試者的新鮮糞便,且于排便后2 h內處理糞便樣品,分別將樣品稱重并用無菌磷酸鹽緩沖液1∶10 (w/v)稀釋[9]。充分振蕩后,經4層紗布過濾制成糞便菌懸液[10]。

1.2.3 糞便菌群對非消化糖的發酵 接種糞便菌懸液:分別向配制好的體外發酵培養基中加入0.5 mL糞便菌懸液[11],充分振蕩。接種完成后,厭氧培養并于37 ℃發酵24 h,得到糞便發酵液樣品。

1.2.4 糞便發酵液中部分細菌的檢測

1.2.4.1 細菌DNA的提取 參照天根細菌DNA提取試劑盒說明書提取糞便發酵液中細菌總DNA。提取后放置于-80 ℃保存備用。

1.2.4.2 部分細菌的絕對定量 選擇糞便中的主要細菌(雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬)的高效特異性引物,并進行驗證(表1)。對上述細菌進行絕對定量qPCR,反應體系:樣本DNA模板2 μL;SYBR Green Super Mix 10 μL;上、下游引物各 0.7 μL;50×ROX Reference Dye 1 μL;滅菌蒸餾水5.6 μL;擴增條件:95 ℃預變性15 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,40個循環,每個樣本重復檢測3次。將擴增的六種目的基因連接于pMD 19-T載體上,然后轉化到DH5α宿主中。測定轉化成功的陽性質粒濃度,根據分子質量計算拷貝數,并進行梯度稀釋,作為絕對定量qPCR的標準物,制備標準曲線[12]。將1.2.4.1中提取的糞便發酵液樣品細菌DNA進行熒光定量PCR檢測,操作方法和條件與標準曲線制作時一致。待測樣品的Ct值結合標準曲線即可計算出各樣品中六個目標細菌的含量[13]。

表1 細菌16S rDNA引物序列Table 1 Primer pairs for bacterial 16S rDNA

1.2.5 乳酸及短鏈脂肪酸含量的測定 分別取乳酸、乙酸、丙酸和丁酸標準品,加去離子水配制為50 mmol/L的標準儲備液,稀釋至合適濃度并混合作為液相色譜的混合標準品。

取2 mL培養完成的糞便發酵液分別于13000 r/min離心15 min,除去菌體及其他顆粒物[10]。取1.5 mL發酵上清液經0.22 μm濾膜過濾后,使用液相色譜儀檢測乳酸及短鏈脂肪酸。

高效液相色譜條件:色譜柱BIO-RAD Aminex HPX-87H柱(300 mm×78 mm,9 μm)。流動相為5 mmol/L的H2SO4,流速為0.5 mL/min,柱溫為50 ℃,進樣量為10 μL,210 nm紫外檢測器[11]。

定性與定量:以乳酸、乙酸、丙酸、丁酸標準品的保留時間和峰面積對非消化糖發酵后所含的有機酸進行定性和定量分析。

1.3 統計學分析

上述實驗均獨立重復三次,采用SPSS 24軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)分析方差,采用 Duncan法進行多重比較,P<0.05為差異顯著。試驗數據表示為“平均值±標準差”。

2 結果與討論

2.1 主要目標細菌的標準曲線

六種引物經qPCR熔解曲線分析,熔解曲線均為單峰(圖略),說明擴增產物單一,產物均為目的DNA片段。采用實驗方法中所述的qPCR擴增條件,建立拷貝數的對數和定量PCR反應過程中達到熒光閾值的初始循環數(Ct)的回歸方程(表2),在測定范圍內各樣品均具有較好的線性關系,R2均在0.99以上。

表2 菌屬含量的回歸方程及決定系數Table 2 Regression equation for bacterialcontent and determination coefficient

注:表中x代表標準物拷貝數的對數,y代表達到熒光閾值的初始循環數(Ct)。

2.2 五種非消化糖經一月齡嬰兒糞便菌群發酵后發酵液中主要細菌的含量

低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、聚葡萄糖、菊粉對一月齡嬰兒糞便菌群中主要細菌的作用有所差異(表3、圖1)。五種非消化糖均能促進嬰兒糞便菌群中乳酸桿菌、雙歧桿菌的生長,其中低聚果糖對乳桿菌和雙歧桿菌的促進作用最強(P<0.05),與不含碳源的空白組中菌屬含量的比值分別為1.07、1.12。表3可知一月齡嬰兒糞便發酵五種非消化糖后,糞便發酵液中的雙歧桿菌含量均高于乳桿菌。菊粉可以顯著促進擬桿菌的生長(P<0.05),與空白組中菌屬含量的比值為1.15。五種非消化糖均能抑制梭菌屬的生長(P<0.05),低聚果糖對其抑制作用最強,與空白組中菌屬含量的比值為0.92。低聚半乳糖可顯著抑制糞便菌群中腸桿菌的增殖,與空白組中菌屬含量的比值為0.98。低聚木糖可顯著減少糞便發酵液中腸球菌的含量(P<0.05),與空白組中菌屬含量的比值為0.97。

圖1 糞便菌群發酵五種非消化糖后發酵液中主要細菌含量與空白組的比值Fig.1 The ratio of main bacterial content in the fermentedfive non-digested polysaccharides to the blank group

嬰兒腸道菌群的定殖與發展是連續的動態變化的過程,腸道菌群的失衡會提高嬰兒患免疫和代謝疾病的風險,嬰兒時期腸道菌群對嬰兒及成年后的機體健康均具有積極的生理意義[18]。

表3 糞便菌群發酵非消化糖后其中主要細菌的含量(lg copies/mL)Table 3 The content of bacterial in anaerobic fermentation broth(lg copies/mL)

注:右上角標字母a～g表示同列結果比較的差異顯著性,字母不同代表差異顯著,即P<0.05;表5同。此外,腸道菌群能夠分泌多種酶,參與未消化完全的營養物質的代謝,對嬰兒的代謝也有著至關重要的作用[19]。嬰兒腸道菌群可利用非消化糖,并產生乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等對機體有益的代謝產物,滿足菌體自身及嬰兒的營養需要[20]。生成代謝產物的種類與含量主要取決于嬰兒腸道菌群的組成及菌群可利用的底物種類[21]。

雙歧桿菌和乳桿菌是嬰兒腸道中具有益生作用的重要微生物,可在腸道中合成多種維生素和氨基酸,增強Fe2+、維生素D和鈣的吸收,還可以通過產生乙酸來防止腸道致病菌感染,維持嬰兒腸道健康[22]。本研究各實驗組中的非消化糖均能促進雙歧桿菌和乳酸桿菌和生長。其中,低聚果糖對雙歧桿菌的促進作用最強(P<0.05),低聚果糖對乳桿菌生長的促進作用最為顯著(P<0.05)。低聚果糖對乳桿菌的促進作用略低于雙歧桿菌。周景欣等[23]的研究表明,低聚果糖可促進成人糞便中雙歧桿菌和乳桿菌的生長,對前者的促進作用高于后者,發酵后雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的含量與未加碳源空白組的比值分別為1.20和1.09。與本研究相比,低聚果糖對成人雙歧桿菌和乳桿菌的促進作用強于對一月齡嬰兒的菌群的作用,這是由于固體食物的引入后,腸道菌群中會富含更多利用非消化糖的功能的基因編碼,有助于菌體對非消化糖的利用[19]。

擬桿菌是在腸道中定植的優勢菌群,擬桿菌屬也是腸道中降解碳水化合物的主要微生物,可提高食物中營養物質的利用率,在促進腸道發育方面具有重要作用[24]。本研究所有實驗組的非消化糖均能促進擬桿菌的生長,其中菊粉組最優。而Hughes等人[11]采用成人糞便體外發酵菊粉時發現,菊粉可顯著抑制糞便中擬桿菌的生長。此差異可能由于嬰兒與成人源擬桿菌產生的多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶的含量不同[25]。

腸球菌屬和腸桿菌屬是腸道內的條件致病菌[26]。本研究發現:僅有低聚半乳糖可減少嬰兒糞便中腸桿菌的含量(P<0.05),而其他非消化糖對腸桿菌則無抑制作用。低聚木糖可顯著降低一月齡嬰兒糞便菌群中腸球菌的含量(P<0.05),這與徐海燕等人[27]通過成人糞便體外發酵低聚木糖的結果一致,表明低聚木糖也可減少成人糞便菌群中腸球菌的含量。梭菌屬也是嬰兒腸道中數量較多的一類細菌,大部分梭菌屬菌株會對機體構成一定的威脅,腸道中梭菌屬的含量增多對機體有致癌作用[28]。除低聚木糖組外,本研究各實驗組的非消化糖均可減少糞便中梭菌屬的含量(P<0.05),其中,低聚果糖組的梭菌屬含量最低。Hughes等人[11]研究表明,成人糞便發酵菊粉后,其中梭菌屬的含量下降(P>0.05)。可見成人和嬰兒糞便菌群體外發酵非消化糖時,梭菌屬受到的影響不同,此差異可能由于嬰兒時期雙歧桿菌屬和乳桿菌屬為優勢菌屬含量較多,對梭菌屬的增殖起到了競爭抑制的作用[29]。

2.3 有機酸標準品的回歸方程

采用液相色譜方法分析有機酸標準品(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸),發現四種酸可以被色譜柱有效分離(圖2),保留時間分別為14.5、17.4、20.5和25.3 min。在測定范圍內,各標準品均具有較好的線性關系,R2均在0.999以上(表4)。

表4 有機酸標準品的回歸方程及決定系數Table 4 Regression equations with correlation coefficientsfor organic acid and coefficient of determination

注:表中x代表標準品的摩爾濃度(mmol/L),y代表的是色譜峰面積值。

圖2 四種有機酸的HPLC分析色譜圖Fig.2 HPLC analysis chromatogram of four organic acids注:峰1:乳酸;峰2:乙酸;峰3:丙酸;峰4:丁酸。

2.4 五種非消化糖經一月齡嬰兒糞便菌群發酵后所產有機酸分析

五種非消化糖經嬰兒糞便菌群發酵后,發酵液中乳酸和總短鏈脂肪酸的含量均顯著增多(P<0.05)(表5)。低聚果糖組中乳酸、乙酸及丁酸的含量最高(P<0.05),發酵液中三種有機酸含量分別為23.00、11.10、1.47 mmol/L,且嬰兒糞便發酵低聚果糖生成的乳酸及各種短鏈脂肪酸的總含量最高為40.03 mmol/L;低聚木糖促進丙酸生成的能力最強(P<0.05),發酵液中丙酸含量為5.35 mmol/L。低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉組中乳酸及各種短鏈脂肪酸的相對含量由高到低均依次為:乳酸、乙酸、丙酸、丁酸;低聚木糖組和聚葡萄糖組中相對含量由高到低均依次為:乙酸、乳酸、丙酸、丁酸。

表5 五種非消化糖經嬰兒糞便菌群發酵后短鏈脂肪酸及乳酸含量(mmol/L)Table 5 Short-chain fatty acids and lactic acid content of five non-digestible polysaccharides fermented by infant fecal(mmol/L)

腸道菌群可通過發酵未消化的碳水化合物產生乳酸各種短鏈脂肪酸來維持機體健康,其中乙酸、丙酸、丁酸,約占SCFAs總量的90%以上[30]。菌群的代謝過程是腸道菌群與宿主間相互作用最重要的體現,腸道菌群代謝產物的種類和含量與人類機體健康與病理狀況之間的直接聯系[31]。本研究中五種非消化糖經一月齡嬰兒糞便菌群發酵后,發酵液中乳酸和各種短鏈脂肪酸的含量均顯著增多(P<0.05),其中嬰兒糞便發酵低聚果糖產生的乳酸及短鏈脂肪酸的總含量最多。說明一月齡嬰兒腸道菌群代謝低聚果糖生成對機體有益的代謝產物的作用最強(P<0.05),同時低聚果糖也可顯著促進一月齡嬰兒糞便中雙歧桿菌和乳桿菌的生長(P<0.05),綜合對比五種非消化糖對一月齡嬰兒糞便中益生菌群促進作用及生成有益代謝產物的能力,低聚果糖是最適于促進一月齡嬰兒腸道健康的非消化糖。此外,五種非消化糖經一月齡嬰兒糞便發酵后產生的短鏈脂肪酸的含量由高到低依次為乙酸、丙酸、丁酸。與本研究相似,Jonathan等人[32]通過成人糞便體外發酵菊粉和低聚果糖,各組發酵液中的短鏈脂肪酸含量由高到低依次為乙酸、丙酸、丁酸。盡管嬰兒和成人的糞便中優勢菌群有明顯差異,但發酵非消化糖生成代謝產物的趨勢明顯的相似,這是由于腸道菌群代謝方面的功能冗余的特性[33]。

3 結論

低聚果糖可促進一月齡嬰兒糞便菌群中雙歧桿菌屬、乳桿菌屬的生長,抑制梭菌屬的增殖,與不含碳源的空白組中菌屬含量的比值分別為1.12、1.07、0.92;低聚半乳糖可抑制糞便菌群中腸桿菌的增殖,與空白組中菌屬含量的比值為0.98;低聚木糖可降低糞便中腸球菌屬的含量,與空白組菌屬含量的比值為0.97。低聚果糖經糞便發酵生成的乳酸、乙酸、丁酸均為最高,含量分別為23.00、11.10、1.47 mmol/L,且生成的有機酸總含量也為最高,含量為40.03 mmol/L;低聚木糖組發酵液中丙酸含量最高,含量為5.35 mmol/L。結果表明,綜合對比五種非消化糖對一月齡嬰兒糞便中益生菌群促進作用及生成有益代謝產物的能力,低聚果糖是最適于促進一月齡嬰兒腸道健康的非消化糖。在試圖通過非消化糖調節嬰兒腸道菌群時,應注意食物因子的選擇不同于成人。