一種檢測雜環胺類化合物的酶聯免疫檢測方法的建立

(天津科技大學食品工程與生物技術學院,食品營養與安全國家重點實驗室,天津 300457)

雜環胺(Heterocyclicaromaticamines,HAAs)是富含蛋白質的物質在進行熱加工時形成的一種物質[1]。截至目前已經在熟食中分離出了約30種誘變型雜環胺[2]。這些雜環胺可以分為氨基咪唑氮雜芳烴類(AIA)與氨基咔啉類[3]。肉類在日常飲食中必不可少,家庭條件下對肉類的烹調溫度一般在170～230 ℃[4],而兩類雜環胺中的氨基咪唑氮雜芳烴類的形成溫度范圍為100～300 ℃[5],所以,日常肉制品中易形成該類雜環胺。相關研究表明,如果長時間攝入含有雜環胺的食品,患癌的幾率將會增加,尤其是結腸、乳腺以及肝臟方面的癌癥[6]。為確保食品安全,實現對雜環胺的快速而準確的檢測具有十分重要的意義。

目前,雜環胺的檢測手段主要有高效液相色譜[7]、液相色譜-質譜法[8-10]、氣相色譜、氣相色譜-質譜法[11]以及熒光檢測[12]等方法,這些檢測方法都有著靈敏度高、準確性好的特點,但對儀器、操作過程以及財力的要求較高[13-15]。免疫分析方法對儀器的要求較低,并且具有檢測速度快、檢測結果靈敏準確等特點。目前關于采用免疫分析方法檢測雜環胺的報道較少,Martin等人[16]制備了PhIP的四種結構類似物PhIP-1,-2,-3和-4的抗體,并對4種抗體之間的特異性和選擇性進行了研究;Sheng等人[17]制備了IQ的抗體并建立了直接競爭酶聯免疫分析方法(dc-ELISA),這些方法只能夠針對雜環胺中的一種物質進行檢測,而雜環胺在肉制品中的含量較低,所以建立一種可以同時檢測肉制品中多種雜環胺的檢測方法具有重要意義。

本文主要針對廣譜性多克隆抗體的制備開展研究,以雜環胺2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)為原料,將其與丁二酸單甲酯酰氯(MCO)反應合成雜環胺半抗原,通過活化酯法將半抗原與蛋白偶聯制備免疫原進一步制備多克隆抗體,最終建立間接競爭酶聯免疫分析方法(ic-ELISA)。旨在建立能夠同時檢測多種雜環胺的酶聯免疫分析方法,為加工肉制品中雜環胺的檢測和監控提供有用的工具。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]喹啉(IQ)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹啉(MeIQ)、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(IQx)、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(7,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(4,7,8-TriMeIQx)、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶(PhIP)、2-氨基-9H-吡啶[2,3-b]吲哚(AαC)、1-甲基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚(Harman)、9H-吡啶[3,4-b]吲哚(Norharman)、丁二酸單甲酯酰氯(MCO)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 美國Sigma公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 美國Sigma公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 美國Sigma公司;無水二氯甲烷 美國Sigma公司;甲醇(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;新西蘭大白兔 月齡3個月,體重1.5 kg左右,北京興隆實驗動物養殖場。

NGC蛋白純化儀 美國BIO-RAD公司;96孔酶標板 丹麥Nunc公司;F200 PRO酶標儀 美國Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 半抗原合成 在氮氣環境下,向20 mL溶解有0.1 mmol的2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)的無水二氯甲烷溶液中,逐滴加入0.3 mmol濃度為50.29 mmol/L的丁二酸單甲酯酰氯(MCO)-無水二氯甲烷溶液,冰浴反應5 h后,室溫反應過夜[18],薄層色譜(Thin layer chromatography,TLC)監測(展開劑組分及比例為二氯甲烷∶無水甲醇∶氨水=9∶1∶0.1,V/V/V[19])。反應完成后,用飽和NaHCO3溶液去除產物中的氫離子,并用無水Na2SO4干燥,過濾后60 ℃減壓旋蒸,獲得MeIQx半抗原。

1.2.2 偶聯蛋白及抗體制備 稱取1.0 mg半抗原和1.2 mg二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶于0.1 mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,將其加入4 mL溶解有20 mg鑰孔血藍蛋白(KLH)的碳酸氫鈉溶液中,室溫攪拌5 h后,加入0.6 mg EDC,4 ℃反應過夜[18]。將所得反應溶液在4 ℃下用pH7.4的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析3 d,得到雜環胺免疫原MeIQx-KLH。以上述同樣的方法合成包被原MeIQx-OVA,通過紫外掃描(200～550 nm)進行鑒定。采用多點皮下注射法免疫新西蘭大白兔,最后一次免疫后采用股動脈采血法采集全血[20]。4 ℃進行離心(10000 r/min,10 min),收集血清,通過ProteinA-Sepharose 4B親和柱層析法純化抗體。

1.2.3 間接競爭酶聯免疫分析方法(ic-ELISA)的建立

1.2.3.1 間接競爭酶聯免疫分析(ic-ELISA)方法步驟 將包被原(100 μL/well)包被在96孔板上,4 ℃條件下過夜;用PBST洗板3次后,加入200 μL/well封閉液在37 ℃下封閉1 h;用PBST洗板3次后,加入標準品或樣品溶液(50 μL/well)和抗體(50 μL/well),在37 ℃環境中孵育1 h;用PBST洗板4次后,加入酶標二抗(15000倍稀釋,100 μL/well),37 ℃孵育30 min;用PBST洗板5次后,加入底物溶液,37 ℃下顯色15 min;加入硫酸(1.25 mol/L,50 μL/well)終止反應,利用酶標儀在波長450 nm下讀取吸光度值,計算抑制率[21]。

1.2.3.2 包被抗原及抗體稀釋度的確定 選取0.01、0.05和0.1 μg/well的包被抗原量和不同稀釋倍數的抗體進行組合,建立標準曲線,測定不同條件下的OD值,并計算相應的抑制率和IC50值,選取吸光度值在1.0左右、IC50值最低時的條件為最佳包被量和抗體稀釋比例。

1.2.3.3 封閉液選擇及濃度優化 確定包被量及抗體稀釋比例后,分別用0.5%和1%的明膠溶液、0.5%和1%的BSA溶液以及0.5%和1%的脫脂乳粉溶液作為封閉液進行ELISA測定,最終選取吸光度值在1.0左右、IC50值最低時對應的封閉液用于后續實驗。

表1 MeIQx質譜信息Table 1 Mass spectrum information of MeIQx

1.2.3.4 甲醇對間接競爭酶聯免疫分析方法(ic-ELISA)的影響 考慮到進行樣品檢測時需要用甲醇對提取物進行復溶,本實驗使用含0、1%、3%、5%、10%、20%、40%的甲醇的PBS緩沖液,建立標準曲線,考察甲醇對ELISA方法的影響,最終選擇能夠完全溶解樣品提取物且與甲醇含量為0時的IC50值相近的甲醇-PBS混合液為樣品提取液。

1.2.3.5 雜環胺間接競爭ELISA標準曲線的建立 在上述優化條件下,梯度稀釋MeIQx標準品,進行間接競爭ELISA測定,得到不同濃度MeIQx所對應的吸光度值,通過吸光度值計算抑制率,以MeIQx濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標繪制標準曲線,通過進行擬合得到S型標準曲線,通過曲線計算得到本方法的靈敏度(IC50)和檢測限(IC15)。

1.2.4 雜環胺抗體特異性測定 實驗選取與雜環胺MeIQx結構類似的喹啉類雜環胺IQ、MeIQ,喹喔啉類雜環胺IQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、4,7,8-TriMeIQx,吡啶類雜環胺PhIP以及氨基咔啉類雜環胺AαC、Norharman和Harman進行抗體特異性測定,以MeIQx的IC50和結構類似物的IC50之比的百分數為交叉反應率。

1.2.5 樣品前處理方法 將牛肉切成碎末,制成直徑4 cm、厚0.5 cm的薄餅,在200 ℃下油炸2 min[22],然后將油炸過的牛肉和購買的肉松在-80 ℃、0.35 Mpa的條件下進行凍干處理(24 h),取凍干后的樣品1 g,放入50 mL離心管中,加入5 mL乙酸乙酯、2 mL氫氧化鈉溶液,震蕩后超聲萃取10 min,8000 r/min離心10 min,取上清,3 mL乙酸乙酯再次提取,合并上清,46 ℃氮吹至干,1 mL甲醇復溶[23],再加入1 mL正己烷,渦旋混合5 min,8000 r/min離心,取下層清液,46 ℃氮吹至干,用1 mL含有5%甲醇的甲醇-PBS混合液復溶得到樣品提取溶液。

1.2.6 提取液稀釋倍數優化 將1.2.5方法處理得到的樣品提取溶液用PBS分別進行2、4、8、16倍稀釋,通過對比建立的基質曲線和標準曲線,選取基質影響基本消除的稀釋倍數進行后續實驗。

1.2.7 添加回收實驗 向油炸牛肉和肉松樣品中分別添加60、100、300 μg/kg的MeIQx標準品,用方法1.2.5處理樣品,用建立的ic-ELISA方法進行測定并計算回收率。

1.2.8 液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)驗證 參照林翠萍等[10]的液相色譜-串聯質譜聯用分析法進行驗證。液相條件:色譜柱:Zorbax Eclipsw Plus C18柱,2.1 mm×100 mm,3.5(m;流速:0.2 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:1(L;分析時間:23 min;流動相:A:10 mmol/L甲酸水(pH3.5,甲酸調節);B:乙腈;流動相梯度洗脫程序:0～12 min,90% A,10% B;12 min,40% A,60% B;14 min,90% A,10% B。

質譜參數:離子化模式:電噴霧電離正離子模式(ESI+);質譜掃描方式:多反應監測(MRM);霧化氣和碰撞氣:N2;霧化氣壓力:40 psi;毛細管電壓:4000 V;干燥器溫度:350 ℃;干燥器流量:10 L/min;目標物質MeIQx的監測離子對信息見表1。

1.3 數據處理

本文中,酶聯免疫檢測方法中所有實驗數據均為重復3次的實驗結果。采用Origin 9.1軟件統計分析數據,計算標準誤差并繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 半抗原和完全抗原的鑒定

雜環胺MeIQx的分子質量為213.24,MCO分子量為150.56,經1.2.1反應生成分子量為327.34的產物,圖1顯示有很明顯的328.53加氫峰即[M+H]+,MS(ESI)數據與化合物的分子量(327.24)吻合,合成產物為目標化合物。將合成的半抗原分別偶聯KLH和OVA,得到免疫原MeIQx-KLH和包被原MeIQx-OVA。由圖2可以看出,二者的紫外最大吸收峰分別在274、271 nm處,在MeIQx半抗原的影響下,相對于純蛋白KLH和OVA的最大吸收峰位置(278 nm)均向左發生了偏移[23],后期產生的相應抗體和建立的檢測方法也充分證明,免疫原MeIQx-KLH和包被原MeIQx-OVA偶聯成功。

圖1 MeIQx半抗原的質譜分析圖Fig.1 Mass analysis diagram of hapten MeIQx

圖2 MeIQx-KLH免疫原和MeIQx-OVA包被原的紫外掃描圖Fig.2 Ultraviolet spectrum of immunogenMeIQx-KLH and MeIQx-OVA

2.2 包被量及抗體稀釋度的確定

包被量及抗體稀釋度的優化結果如圖3所示。由圖3可以看出,包被量相同時,隨著抗體稀釋倍數的增大,IC50值減小。針對不同包被量,當包被量為0.05 μg/well、抗體稀釋倍數為1∶10000時對應的IC50值最小,但此時的OD值小于0.8,不利于檢測。而當包被量為0.05 μg/well、抗體稀釋倍數為1∶9000時,對應的OD值在1.0左右且IC50值較小,所以最佳包被量確定為0.05 μg/well,最佳抗體稀釋倍數為1∶9000。

圖3 包被量和抗體稀釋倍數的優化Fig.3 Optimization of the amout of immobilizedcoating-antigen and antibody concentration

2.3 封閉液的優化

由圖4可以看出,封閉液的種類及其濃度對ELISA方法均有影響,當用BSA和明膠溶液進行封閉時,IC50值均大于用乳粉溶液封閉時的IC50值,且用乳粉溶液進行封閉時OD值在1.0左右,相對于1%乳粉作封閉液,0.5%乳粉作為封閉液時對應的IC50值最小,因此選擇0.5%的乳粉封閉液用于后續實驗。

圖4 封閉液的優化Fig.4 The optimization of blocking solution

2.4 甲醇含量對間接競爭酶聯免疫分析(ic-ELISA)方法的影響

為了將樣品提取物充分溶解,需要用含有一定量甲醇的甲醇-PBS混合液對提取物進行復溶,但是甲醇會對ELISA方法的靈敏度產生影響。如圖5所示,甲醇含量為1%、3%及5%時的IC50值與甲醇含量為0時的IC50值比較接近,可見該范圍內的甲醇含量對ELISA方法的影響不明顯;當甲醇含量達到10%時,IC50值開始變大,并且隨著甲醇濃度的增大,OD值開始下降、IC50值明顯增大,說明10%以上的甲醇含量會對ELISA方法產生影響。但鑒于甲醇含量越多,越有助于樣品提取物的溶解,所以本實驗選取含有5%甲醇的PBS緩沖液復溶樣品提取物。

圖5 甲醇含量對間接競爭酶聯免疫分析(ELISA)方法的影響Fig.5 The influence of methanol concentration on ic-ELISA

2.5 雜環胺間接競爭ELISA標曲的建立

經過上述一系列的優化,所建立的MeIQx雜環胺間接競爭酶聯免疫分析方法(ic-ELISA)的最優工作條件為:0.05 μg/well包被抗原、1∶9000稀釋抗體、0.5%乳粉作為封閉液。在上述條件下,按照1.2.3.1方法建立標準曲線,通過四參數擬合得到S型標準曲線如圖6所示,

曲線方程為y=95.11452+(-1.38549-95.11452)/[1+(x/70.25321)0.9012](R2=0.99984),通過計算得出本方法的靈敏度IC50=81.16±3.15 μg/L,檢測限IC15=12.07±1.43 μg/L。

圖6 間接競爭酶聯免疫分析方法標準曲線Fig.6 Standard curve of MeIQx by ic-ELISA

2.6 雜環胺抗體特異性測定

配制與MeIQx結構類似的其他幾種雜環胺(IQ、MeIQ、IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、4,7,8-TriMeIQx、PhIP、AαC、Norharman和Harman)的標準溶液,用建立的ELISA進行檢測,測定IC50值并計算交叉反應率,考察所制備的雜環胺抗體對其他雜環胺的識別能力,由表2可以看出,MeIQx抗體可以對喹啉類雜環胺(IQ、MeIQ)、喹喔啉類雜環胺(IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、4,7,8-TriMeIQx)以及吡啶類雜環胺(PhIP)進行識別,與上述各種雜環胺的交叉反應率均在93%以上;而對氨基咔啉類雜環胺(以AαC、Norharman和Harman為例)沒有明顯的識別能力。說明本實驗所制備的MeIQx抗體能夠識別大部分氨基咪唑氮雜芳烴類雜環胺,具有很好的廣譜性,所建立的方法可以對食品中的喹啉類雜環胺、喹喔啉類雜環胺以及吡啶類雜環胺的總量進行檢測。

表2 交叉反應測定結果Table 2 The result of cross-reactivity

2.7 提取液稀釋倍數優化

續表

基質曲線與標準曲線基本吻合,基質影響消除,因此,油炸牛肉樣品提取液經4倍稀釋后可以用來進行ELISA檢測;不同稀釋倍數的肉松樣品提取液所對應的基質曲線如圖7(B)所示,由圖7(B)可以看出,2倍稀釋肉松樣品提取液時,基質曲線偏離標準曲線較遠,說明此時的基質影響比較明顯,對提取液稀釋4、8及16倍時,基質曲線與標準曲線基本吻合,基質影響消除,因此,肉松樣品提取液經4倍稀釋后可以用來進行ELISA檢測。

表3 ELISA和LC-MS/MS的回收試驗結果Table 3 The recovery experiment results of ELISA and LC-MS/MS(n=3)

圖7 油炸牛肉樣品(A)和肉松樣品(B)的稀釋度優化Fig.7 Dilution optimization of fried beef sample(A)and dried meat floss(B)

2.8 添加回收實驗結果

以本文建立的間接競爭酶聯免疫分析方法(ic-ELISA)為檢測手段,對油炸牛肉樣品和肉松樣品進行添加回收實驗,結果如表3所示。由表3可知,ic-ELISA測得的添加回收率在91.18%～98.64%之間,LC-MS/MS法測得的添加回收率在86.69%～91.11%之間。對ic-ELISA測得的添加回收率與LC-MS/MS法測得的添加回收率進行線性回歸分析見圖8。由圖8可以看出,兩種方法的檢測結果有較好的一致性(R2=0.9927)。此外,對間接競爭酶聯免疫分析方法(ic-ELISA)和LC-MS/MS法的檢測結果進行比對可以發現,間接競爭酶聯免疫分析方法(ic-ELISA)的回收率高于LC-MS/MS法,其原因可能在于ELISA方法的樣品前處理方法簡單,不需要經過固相萃取等復雜的提取步驟,樣品中的雜環胺標準品損失較少,由此可見,用ic-ELISA在對雜環胺進行檢測時,操作簡單且結果較為準確。

圖8 油炸牛肉樣品和肉松樣品ELISA和LC-MS/MS回收試驗結果的一致性分析Fig.8 Consistency analysis of ELISA and LC-MS/MS recovery experiment results of fried beef samples and dried meat floss

3 結論

本文通過合成雜環胺半抗原,制備了雜環胺免疫原并獲得了廣譜性雜環胺多克隆抗體,本文利用該抗體建立了間接競爭酶聯免疫分析方法(ic-ELISA),方法靈敏度(IC50,以MeIQx計)為81.16 μg/L,檢測限(IC15)為12.07 μg/L。該抗體能夠廣譜識別喹啉類雜環胺(IQ、MeIQ)、喹喔啉類雜環胺(IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、4,7,8-TriMeIQx)以及吡啶類雜環胺(PhIP),交叉反應率均在93%以上;此外,本文建立的ic-ELISA對油炸牛肉和肉松樣品中雜環胺(MeIQx)的添加回收率均在91.18%以上,并且該方法的檢測結果與LC-MS/MS法檢測結果具有較好的一致性(R2=0.9927)。綜上,本文所建立的雜環胺酶聯免疫檢測方法可以對加工肉制品中喹啉類、喹喔啉類以及吡啶類雜環胺的總量進行準確、快捷的檢測,可以為安全的飲食提供保障。在以后的研究中,還可以利用該抗體能夠識別喹啉類、喹喔啉類以及吡啶類雜環胺這一廣譜性特點,可以開展更廣泛的應用,建立更加快速、更加靈敏的新型檢測方法。