異硫氰酸芐酯、乳酸鏈球菌素和麝香草酚復配物的抑菌活性

班芳芳,胡梁斌,莫海珍,趙巖巖,李紅波,周 威

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)是常見的食源性致病菌,可導致食物中毒。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的革蘭氏陽性病原菌,它能引起從呼吸系統到皮膚的各種感染[1]。大腸桿菌是生活在人類腸道中兼性厭氧的革蘭氏陰性菌。一些特殊血清型的大腸桿菌會導致嚴重的腸道和外源性感染,引起腸道(腸炎、腹瀉或痢疾)或腸外疾病(尿路感染、敗血癥或腦膜炎)[2]。近年來由于抗生素的濫用,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌耐藥頻率增加,特別是一些多重耐藥(Multi drug resistance,MDR)菌,如耐甲氧西林(Methicillin-resistantS.aureus,MRSA)[3]。耐藥菌感染問題已經給人們帶來了嚴峻的挑戰。

開發新藥是解決以上問題的出路,其中天然活性成分由于低毒及良好的抑菌活性受到研究者的青睞。而對于那些抑菌作用相對較弱的生物活性物質,各種成分之間的復配是增強抑菌作用的一種很好的方式[4-5]。本實驗中所用的天然活性成分分別為異硫氰酸芐酯(Benzyl isothiocyanate,BITC)、麝香草酚(Thymol)和乳酸鏈球菌素(Nisin),它們都是經聯合國糧食和農業組織(The Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)和世界衛生組織(World Health Organization,WHO)批準可在食品中使用的一種食品添加劑。BITC是從金蓮花和水芹及其他的一些十字花科植物中分離得到的,可以通過誘導細菌膜完整性的喪失來控制細菌的感染[6]。Thymol是廣泛存在于百里香屬、羅勒屬、牛至屬、香薄荷屬、延布拉屬和美國薄荷屬等唇形科植物精油的主要單萜酚,易揮發,具有抗氧化劑[7]、抗炎[8]、抗病毒[9]、抗腫瘤[10]、抗菌作用[11]。Thymol的殺菌機理在于它可使細胞膜發生膜穿孔,導致細胞內容物的泄露[12]。Nisin是從乳球菌中分離出來的一種無味、無色、低毒的天然抗菌肽,其對革蘭氏陽性菌具有較高的抗菌活性,比如李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、植物乳桿菌、滕黃微球菌和黃色微球菌[13-18]。但是這三種活性成分之間的復配及復配后的抑菌作用尚未有人研究,本文將采用復配的方法來研究它們對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果。利用棋盤法將異硫氰酸芐酯、乳酸鏈球菌素和麝香草酚兩兩之間進行復配,并結合基于LA理論非參數模型的FICI模型和BI理論非參數模型的ΔE模型對抑菌結果進行評價,以期為天然活性成分的抑菌研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌ATCC25923(S.aureusATCC25923)、大腸桿菌MG1655(E.coliMG1655) 美國賓西法尼亞大學;Nisin、Thymol、BITC和DMSO Sigma公司。

ZWY-1102C恒溫培養振蕩箱 中國智城分析儀器制造有限公司;BE-9010微孔板恒溫振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;多功能酶標儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;SW-CJ-2F D雙人單面垂直凈化工作臺 中國蘇州智凈凈化有限公司;78-1型磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市中大儀器廠;Pico 17高速離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;WFJ 7200型可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;HVE-50高壓滅菌器 Hirayama Manufacturing Corporation;PL303電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化S.aureusATCC25923和E.coliMG1655的活化:將保存在-80 ℃冰箱中的S.aureusATCC25923和E.coliMG1655取出,取少許菌液冰碴分別在TSB和LB固體培養基上進行劃線接種,37 ℃靜置、過夜培養。

1.2.2 天然活性成分單用的抑菌活性測定 挑取S.aureusATCC25923和E.coliMG1655單克隆于無菌的TSB和LB液體培養基中,并在37 ℃、200r/min的條件下進行過夜培養,然后按照體積比200∶1(TSB液體培養基∶菌液)進行轉接,待其OD600=0.8～1.0時,調菌液OD600=0.1,然后在此基礎上稀釋100倍備用。將BITC與Thymol用DMSO溶劑稀釋;Nisin用0.02 mol/L的稀鹽酸稀釋,分別配制成不同梯度濃度的溶液,即BITC為0、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL;Thymol為0、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL;Nisin為0、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL。體系中DMSO的劑量均不高于1%。最后將配置好的一系列梯度濃度的活性成分分別吸取5 μL加至含有195 μL菌液稀釋液的96孔板中(200 μL體系),于37 ℃的恒溫培養箱培養24 h,通過酶標儀測定600 nm波長下96孔板中各菌孔的OD600值,計算細菌生長率。

生長率(%)=(各試驗孔OD值/空白對照孔OD值)×100。

1.2.3 天然活性成分兩兩聯用的抑菌活性測定 藥物相互作用模型。為了評估3種天然活性成分對兩種菌株的體外相互作用,本文采用基于兩種無交互理論的非參數化方法LA理論和BI理論對結果進行分析[19]。

BI模型:BI方程所描述的理論可用等式Ii=IA+IB-IA×IB來表示,Ii是藥物A和B理論上非相互作用結合的抑菌率,IA和IB是藥物A和B單用時的實際抑菌率。而I=1-E,E是生長率,通過替換到原方程,方程推導如下:Ei=EA×EB,Ei是藥物A和B理論上非相互作用結合的生長率,EA和EB是藥物A和B單用時的實際生長率。不同濃度組合相互作用的類型可以通過藥物在不同濃度下理論和實際生長百分比之間的差異(ΔE)來描述。若平均ΔE>0,則有95%的可能性說明此濃度組合有協同作用;相反,若平均ΔE<0,則有95%的可能性說明此濃度組合有拮抗作用。而不同濃度組合的總體聯用效果可以通過顯著協同(∑SYN)和拮抗(∑ANT)相互作用的總和百分比來評價。若顯著相互作用總和小于100%,被認為是弱相互作用;顯著相互作用在100%～200%,被認為是中等相互作用,顯著相互作用在200%以上,被認為是強相互作用。

圖1 BITC、Nisin與Thymol分別對S. aureus ATCC25923和E. coli MG1655的最小抑菌濃度Fig.1 MIC of BITC,Nisin and Thymol against S. aureus ATCC25923 and E. coli MG1655注:A、C、E分別為BITC、Nisin、Thymol對S. aureus ATCC25923的最小抑菌濃度;B、D、F分別為BITC、Nisin、Thymol對E. coli MG1655的最小抑菌濃度。

在96孔板每個孔內加入190 μL菌液稀釋液,然后將稀釋好的BITC與Nisin各吸取5 μL,按照棋盤法進行交叉組合。Thymol與Nisin、Thymol與BITC也分別進行同樣的交叉組合,并將活性成分組合后的96孔板放至37 ℃的恒溫培養箱內培養24 h,然后測量各個96孔板的OD600值,并根據以上的評價模型對結果進行評價。

1.3 數據處理

使用Excel軟件進行數據處理和繪圖,其中的最小抑菌濃度曲線由OriginPro 8.5軟件繪制。每個處理組進行三次平行實驗。

2 結果與分析

2.1 BITC、Nisin與Thymol單用時的抑菌作用

利用微量稀釋法測定BITC、Nisin和Thymol分別對S.aureusATCC25923和E.coliMG1655的最小抑菌濃度。由圖1可以看出,BITC、Nisin和Thymol對S.aureusATCC25923最小抑菌濃度分別為64、256、256 μg/mL;而對E.coliMG1655的最小抑菌濃度分別為128、>8、256 μg/mL。

2.2 BITC、Nisin與Thymol兩兩聯用時的抑菌效應

BITC、Nisin和Thymol單用及聯用時的抑菌活性結果如表1所示。BITC、Nisin與Thymol單用時對S.aureusATCC25923的IC50分別是32、128和128 μg/mL。當BITC、Nisin與Thymol兩兩聯用時,BITC的使用濃度由32 μg/mL降至最低8 μg/mL;Nisin的使用濃度由128 μg/mL最低降至8 μg/mL;Thymol的使用濃度由128 μg/mL降至最低32 μg/mL。BITC、Thymol與Nisin單用時對E.coliMG1655的IC50分別是64、384和16384 μg/mL。當BITC、Thymol與Nisin兩兩聯用時,BITC的使用濃度由64 μg/mL最低降至16 μg/mL;Nisin的使用濃度由128 μg/mL最低降至8 μg/mL;Thymol的使用濃度由384 μg/mL降至最低64 μg/mL。結果表明,三種天然活性成分兩兩聯用可以降低其各自的抑菌使用劑量。

表1 BITC、Nisin和Thymol單用及聯用時的抑菌活性Table1 Antibacterial activity of BITC,nisin and thymol exposed alone and in combination

表2 Nisin、BITC與Thymol體外兩兩聯用效果Table 2 In vitro interaction among BITC,nisin and thymol

表3 S. aureus ATCC25923經Nisin-BITC處理后的生存率Table 3 Survival rate of S. aureus ATCC25923 treated with Nisin-BITC compound

2.2.1 BITC-Nisin之間的抑菌效應 基于LA理論非參數模型的FICI法,通過計算可知,BITC-Nisin聯用時對S.aureusATCC25923表現出協同抑菌效應(FICI指數小于0.5,如表2所示),對E.coliMG1655則無相互作用(FICI指數大于0.5,如表2所示),其協同抑菌效果分別如表3和圖2A所示;基于BI理論非參數模型的ΔE法,可知BITC-Nisin聯用對S.aureusATCC25923表現出強協同抑菌作用(∑SYN=537.57,表2),而對E.coliMG1655則表現出弱拮抗作用(∑ANT=85.83,如表2所示),分別如圖2B和2C所示。兩種評價模型表現出較好的一致性。

圖2 BITC-Nisin對S. aureus ATCC25923的抑菌效應定量分析Fig.2 Quantitative analysis of antibacterial effect ofS. aureus ATCC2592 exposed to BITC and nisin注:A為基于LA理論非參數模型下的50%抑菌濃度等效點圖;B和C分別為基于BI理論非參數模型下的BITC-Nisin抑菌的3-D立體指數圖曲面圖和俯視圖。

2.2.2 Nisin-Thymol之間的抑菌效應 如表2所示,Nisin-Thymol聯用對S.aureusATCC25923的FICI值為0.58,∑SYN=288.07,∑ANT=-307.80;對E.coliMG1655的FICI值為0.5007,∑SYN=165.07,∑ANT=-110.07。無論是利用FICI法還是ΔE法對結果進行模型評估,Nisin-Thymol聯用對S.aureusATCC25923和E.coliMG1655均未表現出協同作用,即Nisin-Thymol聯用并沒有提高Nisin或Thymol對S.aureusATCC25923和E.coliMG1655的抑菌效應。

2.2.3 BITC-Thymol之間的抑菌效應 當利用FICI法進行模型評估時,BITC-Thymol聯用對S.aureusATCC25923和E.coliMG1655也均未表現出協同作用(FICI值均大于0.5),而當利用ΔE法進行模型評估BITC-Thymol聯用對S.aureusATCC25923表現出強拮抗作用(∑SYN=0,∑ANT=-219.86);對E.coliMG1655表現出強協同作用(∑SYN=274.77,∑ANT=-19.14),兩種模型評價的結果不一致。

3 討論

為提高天然活性成分對食源性致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果,本文采用棋盤法并結合數學評估模型研究了其兩兩聯用對S.aureusATCC25923和E.coliMG1655是否具有協同抑菌作用。結果表明,Nisin-BITC聯用對S.aureusATCC25923表現出了很好的協同效應。除了Nisin-BITC組合,其他組合均未表現出協同抑菌效果,這可能是因為兩者抑菌機制的不同所導致的。Nisin是一種由核糖體合成,后經翻譯修飾的含有34個氨基酸的抗菌肽,該多肽含有一個硫化雙丙氨酸,4個β-甲基-硫化雙丙氨酸環和一些不常見的殘基,如脫氫丙氨酸、脫氫酪氨酸[22-24]。其抗菌活性與它和細菌細胞質膜上陰離子脂質的相互作用有關,從而導致等離子體膜的擾亂。Nisin陰離子脂質相互作用形成的孔隙會導致三磷酸腺苷(ATP)、氨基酸、預積累的銣或重要離子流失,導致細胞死亡[15,25],它和細胞質膜的相互作用由兩種不同的機制產生。第一種機制,在微摩爾范圍內,Nisin結合膜上的陰離子脂質表現出一種低親和力的滲透;第二種機制中,在摩爾范圍內,Nisin通過特異性識別與細胞靶膜中的脂質II相互作用,然后由4個脂質II分子和8個Nisin分子組成的脂質II依賴通路形成孔隙[11,15]。脂質II介導的孔復合體比無脂質II形成的孔更穩定[26]。而BITC也會誘導細菌膜完整性的喪失,但是其破膜作用只表現在革蘭氏陰性菌上,它對革蘭氏陽性菌只表現出了抑制作用,這很有可能就是BITC和Nisin發揮協同作用的主要原因。它們在抑菌過程中的協同機制還有待驗證和探索。

對于聯合用藥評估模型的方法,除了基于LA理論非參數模型的FICI法[20]和BI理論非參數模型的ΔE法[27],還有同樣基于LA理論全參數濃度效應響應曲面法和BI理論半參數濃度效應響應面方法。E是藥物濃度為DA和DB(自變量)時的OD值(因變量);Emax未加藥物處理的空白對照組的最大OD值;IC50,A和IC50,B分別是藥物A和B抑制50%菌量時的濃度,在數值上是Emax的50%;mA和mB分別是藥物A和B濃度效應曲線(Hill系數)的斜率;α是用來描述天然相互作用的參數。當參數α為正且95%置信區間不含0時,有顯著協同作用,當參數為負且95%置信區間不含0時,有顯著拮抗作用。E、D、Emax、IC50和m跟上述藥物A和B參數相同。當ΔE為正且95%置信區間不包含0時,稱顯著協同作用;當ΔE為負且95%置信區間不含0時,稱顯著拮抗作用。

相關數據表明,BITC、Thymol和Nisin單用的使用量超出一定范圍時具有毒性作用。TOXNEP數據庫(https://toxnet.nlm.nih.gov/)中ChemIDplus庫的數據顯示,Thymol在小鼠中靜脈注射的LD50>110 mg/kg時會出現嗜睡,運動失調;BITC在小鼠中皮下注射的LD50>150 mg/kg時會導致癲癇發作;Nisin在小鼠中靜脈注射的正常使用劑量LD50為100 mg/kg,超出此劑量可能會存在潛在毒性作用。但是三者相互之間復配后的毒性數據尚無收錄,也無相關文獻報道。復配物之間若存在協同作用,會降低各使用成分的濃度,理論上會降低各自的毒性。李宏等發現[28]將含油橄欖葉提取物與化學殺菌劑二氯苯氧氯酚復配后可能存在協同抑菌作用,其復配物的毒性實驗結果為無毒。顧松山等[29]發明了一種含有苯噻菌酯和滅菌唑的滅菌組合物,取得了非常顯著的協同增效作用,且經大量實驗證明,復配后對哺乳動物毒性未有增加。這都與理論相符,但本文所研究的三種活性成分相互之間的復配物的毒性是否具有協同作用仍需進一步的研究。

4 結論

本文結果表明,異硫氰酸芐酯復配物-乳酸鏈球菌素的FICI值為0.29<0.5,∑ΔE值的絕對值為451.74%>200%,評價結果為強協同作用;乳酸鏈球菌素-麝香草酚復配物的FICI值為0.58>0.5,∑ΔE值的絕對值為19.73%<100%,評價結果為弱拮抗作用;異硫氰酸芐酯-麝香草酚復配物的FICI值為1.50>0.5,∑ΔE值的絕對值為219.86%>200%,評價結果為強拮抗作用。除了乳酸鏈球菌素-異硫氰酸芐酯復配物對金黃色葡萄球菌ATCC25923具有強協同抑菌作用,其他組合協同抑菌效果均不明顯。本研究為控制食源性致病菌S.aureus的感染提供了一個天然活性成份復配的配方,即Nisin和BITC復配時的IC50濃度均為8 μg/mL。