猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相組分的分離與鑒定

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(1.廣東輕工職業技術學院食品與生物技術學院,廣東廣州 510300;2.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510641;3.廣東太陽神集團有限公司,廣東廣州 510665)

猴頭菇[Hericiumerincaceus(Bull.:Fr.)Pers],又稱猴頭蘑、猴頭菌、刺猬菌等,屬于擔子菌綱(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、齒菌科(Hydnaceae)、猴頭屬(Hericium)[1],因其子實體圓而厚且與猴子頭部相似而得名。猴頭菇中含有多肽類、多糖類、萜類、甾醇類、酚類等活性成分,具有抗氧化、降血脂、調節免疫力、抗腫瘤、降膽固醇、保肝等多種生物活性[2-3]。

隨著天然產物研究的深入和分離純化方法的不斷改進,已有相關研究報道了從猴頭菇中分離純化得到化合物,并進行了相關的結構鑒定和生物活性評價研究,使得猴頭菇中的化學成分數據得到了豐富。例如Kawagishi等[4-6]以猴頭菇菌絲體為原料,分離出7種二萜類物質,分別稱之為Erinacine A、B、C、D、E、F、G,這種二萜類物質以鳥巢烷型二萜(Cyathane)骨架為基本構型,普遍具有抗菌、抗炎和刺激神經生長因子(NGF)合成等生物活性。Kawagishi等[7]還從猴頭菇子實體中分離純化得到3個酚類物質,并對其進行了結構鑒定以及活性研究,結果發現這些化合物具有較強的促進神經生長因子合成的活性。麻兵繼等[8]以猴頭菇子實體為原料,利用柱色譜技術從其甲醇浸提物中分離純化得到11個化合物,其中包含2個甾醇類化合物。Li等[9]從猴頭菇子實體中分離得到14種甾醇,包括4種新的甾醇和10種已知的甾醇,而甾醇類化合物具有較好的抗病毒、利尿、抗腫瘤以及保護胃黏膜作用。

本課題組前期的研究結果表明[10],猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取物均具有一定的抗氧化活性,其中乙酸乙酯相的抗氧化活性相對較高,對DPPH·、·OH和ABTS+·的清除率分別為41.64%(2.5 mg/mL)、82.84%(2.5 mg/mL)和89.18%(0.5 mg/mL)。由此可見,猴頭菇醇提物的乙酸乙酯相萃取組分具有較好的抗氧化活性,具有較好的繼續研究價值。但是目前對于猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取物中的單體化合物的分離鑒定和活性研究尚缺乏相關數據,對于乙酸乙酯相中的主要功效化合物仍有待進一步研究。而獲取這部分研究數據的前提是需要通過相關分離手段獲取化合物單體。

基于上述背景,本文以猴頭菇子實體為原料,在前期研究[10]的基礎上進一步對猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相進行分離鑒定研究,采用硅膠柱層析和半制備HPLC法對其進行分離純化,將純化得到的單體化合物進行結構表征和鑒定,為猴頭菇中的單體化合物分離以及后續功效實驗提供基礎數據,以期為猴頭菇資源的深度開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇子實體 產自吉林省長白山二道白河;氘帶甲醇 美國Sigma公司;石油醚、乙酸乙酯、甲醇、香草醛、濃硫酸等試劑 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

ZF-90D暗箱式紫外分析儀 上海光豪分析儀器有限公司;BSZ-160F電腦自動部份收集器 上海精科實業有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;島津LC-20AB分析型高效液相色譜儀 日本島津公司;島津LC-20AR半制備型高效液相色譜儀 日本島津公司;Esquire HCT PLUS質譜儀 德國Bruker公司;AVANCE-III HD600超導核磁共振波譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的制備 參考黃越等[10]的方法并稍作改動,按如下流程制備猴頭菇醇提物及其乙酸乙酯萃取組分。具體制備方法如下:

猴頭菇醇提物制備流程:將猴頭菇子實體切成小塊,然后置于50 ℃下干燥16 h,期間不斷翻動以保證干燥均勻,稱取一定量干燥至恒重的猴頭菇子實體干粉,按以下工藝制備猴頭菇醇提物:乙醇濃度50%,料液比1∶15 g/mL,提取溫度50 ℃,提取時間5 h,提取2次,合并2次提取液,在3000 r/min轉速下離心10 min,收集上清液并在45 ℃條件下旋蒸濃縮2～3 h,直至不再有液體旋出,獲得猴頭菇醇提物。

猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的制備流程:將猴頭菇醇提物與少量蒸餾水進行混合,振蕩均勻后形成水懸浮液。分級萃取時選取的有機溶劑依次為石油醚、乙酸乙酯,石油醚萃取操作時按1∶1 (V/V)與水懸浮液進行混合,振蕩10 min后靜置進行萃取,收集石油醚相,剩余相再次用石油醚萃取,重復2次,共萃取3次。剩余水相用乙酸乙酯萃取3次,收集得到猴頭菇醇提物乙酸乙酯相,在45 ℃條件下旋蒸濃縮2～3 h,直至不再有液體旋出,置于-20 ℃下儲存。

1.2.2 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的粗分離 采用硅膠柱層析法對猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相進行粗分離,選用規格為Φ6.0 cm×60 cm的層析柱,采用柱層析用硅膠(100～200目)進行濕法裝柱。取猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相組分30 g,用適量乙酸乙酯將其完全溶解,加入樣品重量1.5倍的硅膠(100～200目)充分攪拌均勻。在旋轉蒸發器里于45 ℃條件下旋干混勻,進行干法上樣。

根據乙酸乙酯相TLC顯色結果確定洗脫劑系統組成。依次采用純石油醚、不同石油醚與乙酸乙酯混合比例(99∶1、98∶2、95∶5、90∶10、80∶20和50∶50,V/V)、純乙酸乙酯、不同乙酸乙酯與甲醇混合比例(19∶1、9∶1和1∶1,V/V)、純甲醇一系列溶劑系統進行梯度洗脫,每種洗脫劑用量均為3500 mL。等量逐份收集洗脫液,用250 mL錐形瓶進行收集,每200 mL收集一次,一共得到A1～A210共210個組分。用毛細管將得到的210個組分快速準確地點樣于GF-254薄層硅膠板上,吹干,用適當的展開劑展開,然后取出吹干,再使用紫外燈、碘和香草醛-硫酸顯色劑進行顯色。觀察各個斑點的相對比移值(Rf),對比分析,將相似組分合并進行再分離純化。通過TLC顯色結果分析,將A36～A81合并作為組分C1,A82～A91合并作為組分C2,A92～A106合并作為組分C3,A107～A115合并作為組分C4,A116～A128合并作為組分C5,A129～A136合并作為組分C6,A137～A143合并作為組分C7,A145～A168合并作為組分C8,A169～A185合并作為組分C9,A186～A210合并作為組分C10。將組分C1～C10在45 ℃條件下旋蒸濃縮3～5 h,直至不再有液體旋出,得到組分C1～C10,以待后續進行分離純化。

1.2.3 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的細分離

1.2.3.1 組分C6的分離純化 硅膠柱層析對組分C6的分離:選用規格為Φ2.6 cm×80 cm的層析柱,用200～300目柱層析用硅膠進行濕法裝柱。稱取2.0 g樣品,進行干法上樣,依次用不同混合比例的石油醚與乙酸乙酯混合比例(10∶1、8∶1、5∶1和1∶1,V/V)、純乙酸乙酯、不同乙酸乙酯與甲醇混合比例(5∶1和5∶4,V/V)一系列溶劑系統進行梯度洗脫,每種洗脫劑用量均為750 mL。等量逐份依次收集洗脫液,通過TLC顯色結果分析,合并相似組分,并在45 ℃條件下旋蒸濃縮20～50 min,得到4個組分C6-1、C6-2、C6-3和C6-4。

半制備型HPLC對組分C6-2的分離:稱取800 mg組分C6-2充分溶于甲醇,過0.45 μm有機濾膜,采用以下條件進行分析與制備。HPLC條件:分析型色譜柱:島津C18柱(5 μm,4.6 mm×150 mm);流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm;進樣量:10 μL;分析時間:50 min,采用梯度洗脫分析。半制備HPLC條件:半制備型色譜柱:LC spherical-C18柱(7 μm,20 mm×300 mm);流速:8 mL/min;檢測波長:254 nm;進樣量:1 mL;分析時間:80 min,使用梯度洗脫程序進行分離操作,洗脫程序如表1所示。

表1 組分C6-2的半制備HPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions for fractionC6-2 with semi-preparative HPLC

1.2.3.2組分C7的分離純化 采用硅膠柱層析對組分C7進行分離,選用規格為Φ1.5 cm×80 cm的層析柱,用200～300目柱層析用硅膠進行濕法裝柱。稱取1.0 g樣品進行干法上樣。采用不同石油醚與乙酸乙酯混合比例(5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和1∶9,V/V)、純乙酸乙酯、不同乙酸乙酯與甲醇混合比例(95∶2、90∶5、90∶10和1∶1,V/V)和純甲醇一系列溶劑系統進行梯度洗脫,每種洗脫劑用量均為250 mL。用電腦自動部分收集器等量逐份收集洗脫液,經TLC檢測分析,合并相似組分,并在45 ℃條件下旋蒸濃縮1～2 h,直至不再有液體旋出,得到8個組分C7-1、C7-2、C7-3、C7-4、C7-5、C7-6、C7-7、C7-8。

硅膠柱層析對組分C7-3的分離:選用規格為Φ 1.5 cm×80 cm的層析柱,用200～300目柱層析用硅膠進行濕法裝柱。將組分C7-3(0.128 g)進行干法上樣。依次用不同石油醚與乙酸乙酯混合比例(1∶4.5、1∶5、1∶7和1∶9,V/V)和純乙酸乙酯一系列溶劑系統進行梯度洗脫,每種洗脫劑用量均為100 mL。用電腦自動部分收集器等量逐份收集洗脫液,經TLC檢測分析,合并相似組分。并在45 ℃條件下旋蒸濃縮20～50 min,得到3個組分C7-3-1、C7-3-2和C7-3-3。

1.2.3.3組分C8的分離純化 稱取組分C8共2.0 g充分溶解于甲醇中,過0.45 μm有機濾膜,采用以下條件進行分析與制備。

分析HPLC條件:分析型色譜柱:島津C18柱(5 μm,4.6 mm×150 mm);流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm;進樣量:10 μL;分析時間:50 min,采用梯度洗脫程序進行分離操作。

半制備HPLC條件:半制備型色譜柱:LC spherical-C18柱(7 μm,20 mm×300 mm);流速:8 mL/min;檢測波長:254 nm;進樣量:1 mL;分析時間:80 min,采用梯度洗脫程序進行分離,洗脫程序如表2所示。

表2 組分C8的半制備HPLC梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution conditions for fraction C8with semi-preparative HPLC

1.2.4 化合物的結構鑒定與分析

1.2.4.1 質譜分析(ESI-MS) 各取少量化合物H1、H2、H3、H4、H5,分別用色譜純甲醇進行充分溶解,通過Esquire HCT PLUS型大容量離子阱對其進行質譜分析,采用正、負離子掃描模式[11],霧化氣和干燥氣為高純氮氣,噴霧氣壓力5 psi,干燥氣流速為4.0 L/min,干燥氣溫度為180 ℃,毛細管電壓為3000 V,掃描范圍為質荷比50～1000 (m/z)。

1.2.4.2 核磁共振分析(NMR) 分別稱取一定量化合物H1、H2、H3、H4、H5,使用氘帶甲醇進行溶解[12],置于核磁管中,用AVANCE-III HD600超導核磁共振波譜儀進行測定,以四甲基硅烷(TMS)作內標,化學位移δ和偶合常數J分別采用ppm以及Hz表示,1H-NMR以及13C-NMR的工作頻率分別為600、151 MHz。

2 結果與分析

2.1 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的粗分離結果

猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相經梯度洗脫、等量逐份收集洗脫液、TLC顯色分析合并,以及旋轉蒸發分別得到組分C1～C10,其中C1共7.68 g,C2共0.167 g,C3共1.2 g,C4共2.98 g,C5共3.18 g,C6共2.41 g,C7共1.28 g,C8共4.94 g,C9共2.88 g,C10共1.06 g。

其中組分C2為無色油狀物,經TLC檢測分析為單一化合物,因此標記為化合物H1(167 mg)。組分C6、組分C7以及組分C8經HPLC分析,相對較易分離得到單一化合物,其他組分所含物質種類復雜,分離難度大,因此選擇組分C6、組分C7以及組分C8進行后續分離純化。

2.2 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的細分離結果

2.2.1 組分C6的分離純化結果 組分C6經梯度洗脫,得到4個組分C6-1、C6-2、C6-3和C6-4,經TLC檢測分析,組分C6-2(0.915 g)可以得到有效分離,因此對組分C6-2進一步采用半制備型HPLC進行分離純化。

組分C6-2的半制備HPLC分離譜圖如圖1所示,根據HPLC分析結果,保留時間為35.011～39.538 min的化合物為單一化合物,因此對其進行收集,并在45 ℃條件下旋蒸濃縮30 min,得到無色針狀結晶,標記為化合物H2(23.1 mg)。

圖1 組分C6-2的半制備HPLC分離譜圖Fig.1 The semi-preparative HPLCchromatogram for fraction C6-2

2.2.2 組分C7的分離純化結果 組分C7經梯度洗脫,得到8個組分C7-1、C7-2、C7-3、C7-4、C7-5、C7-6、C7-7、C7-8,經TLC檢測分析,組分C7-3(128 mg)可以得到有效分離,因此對組分C7-3進一步采用硅膠柱層析進行分離純化。

組分C7-3經梯度洗脫,得到3個組分C7-3-1、C7-3-2和C7-3-3,其中,組分C7-3-1有白色鱗片狀結晶析出,用石油醚反復重結晶后得到白色鱗片狀結晶,經TLC檢測分析為單一化合物,標記為化合物H3(9.4 mg)。

2.2.3 組分C8的分離純化結果 組分C8的制備型HPLC分離譜圖如圖2所示,根據HPLC分析結果,保留時間分別為11.565～14.013 min以及17.576～21.581 min的化合物均為單一化合物,因此對這兩部分分別進行收集,并在45 ℃條件下旋蒸濃縮30 min,分別得到白色針狀結晶(60.4 mg)以及無色片狀結晶(48.3 mg),分別標記為化合物H4和化合物H5。

圖2 組分C8的半制備HPLC分離譜圖Fig.2 The semi-preparative HPLC chromatogram for fraction C8

2.3 化合物H1～H5的結構鑒定

2.3.1 化合物H1的結構鑒定 化合物H1為無色油狀物,由質譜譜圖得出ESI-MS(Negative mode):m/z=281[M-H]-,其分子量為282。

化合物H1的1H-NMR譜數據(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ5.34(1H,t,J=4.7 Hz)為一個烯氫信號,δ2.27(1H,t,J=7.4 Hz)可能為一個炔烴上的質子信號或者與N、S、C=O、Ar相連的碳上的一個質子信號,δ2.05(1H,dd,J=12.7,6.3 Hz)為與雙鍵相連碳上的質子信號,δ1.61(2H,m),1.31(10H,d,J=17.0 Hz),0.94～0.86(2H,m)為飽和碳上的質子信號;化合物H1的13C-NMR譜數據(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ176.29處的碳信號提示分子中含有一個羧基,δ129.46,127.69與1H-NMR譜中提供的雙鍵信息相對應,δ33.56,31.67,29.92～27.46,26.71,24.70,22.33,13.04。

據上述數據分析,并與標準圖譜以及劉天行等[13]報道的油酸譜圖數據基本吻合,由此確定化合物H1為油酸(Oleic acid),分子式為C18H34O2,結構式如圖3。

圖3 化合物H1的化學結構式Fig.3 Chemical structure of compound H1

2.3.2 化合物H2的結構鑒定 化合物H2為無色針狀結晶,由質譜譜圖得出ESI-MS(Negative mode):m/z=329[M-H]-,分子量為330。

化合物H2的1H-NMR譜數據(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ6.89(s,1H)提示分子中存在芳香基團,δ6.13(1H,s)可能為一個雙鍵碳或者芳香基團碳上的質子信號,δ3.88(3H,s)可能為-OCH3中的質子信號,δ2.83(1H,d,J=13.8 Hz),2.72(2H,t,J=6.7 Hz),2.63(1H,d,J=13.8 Hz),1.87(3H,m),1.86(3H,s)可能為飽和碳上或者三鍵碳上的質子信號,δ2.12(3H,d)可能為與三鍵或者雙鍵碳相連碳上的質子信號,δ1.4(3H,s)為飽和碳上的質子信號;化合物H2的13C-NMR譜數據(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ198.94提示分子中存在烯丙氧基結構,δ172.6,158.74為羰基碳的信號特征,δ155.81,148.82,131.10,124.88,124.72,114.17,95.34為雙鍵碳信號,δ75.82,68.27,54.93為-O-CH2中的碳信號,δ51.52,30.51為飽和碳信號,δ26.33,23.68,19.48,16.93為與雙鍵相鄰的碳信號。據上述數據分析,并與Ueda K等[14]報道的從猴頭菇中提取得到的異苯并呋喃酮衍生物Hericenone I的譜圖數據基本吻合,由此確定化合物H2為Hericenone I,分子式為C19H22O5,結構式如圖4。

Ma等[15]在對猴頭菇中具有細胞毒性的芳香化合物研究過程中,分離得到了Hericenone I,研究表明,Hericenone I對人食管癌EC109細胞具有一定的細胞毒性,在濃度為1×10-3mol/L時,其對EC109細胞生長抑制率為65.34%,這可能是因為其具有與霉酚酸相近的結構。

圖4 化合物H2的化學結構式Fig.4 Chemical structure of compound H2

2.3.3 化合物H3的結構鑒定 化合物H3為白色鱗片狀結晶,由質譜譜圖得出ESI-MS(Positive mode):m/z=587[2M+Na]+,其分子量為282。

化合物H3的1H-NMR譜數據(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ1.29(54H,s,27CH2),0.89(6H,t,J=4.45 Hz,2CH3)均為烷烴上的質子信號;化合物H3的13C-NMR譜數據(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ31.67,29.07,22.34,13.04。

據上述數據分析,并與標準圖譜以及Chen Z等[16]報道的正二十九烷的譜圖數據基本吻合,由此確定化合物H3為正二十九烷(n-Nonacosane),分子式為C29H60,結構式如圖5。

圖5 化合物H3的化學結構式Fig.5 Chemical structure of compound H3

陳宇[17]在對小刺猴頭菌的子實體和發酵液中的化學成分進行分析時也發現猴頭菇子實體中含有正二十九烷。與本研究結果一致。

2.3.4 化合物H4的結構鑒定 化合物H4為白色針狀結晶,由質譜譜圖得出ESI-MS(Negative mode):m/z=243[M-H]-,其分子量為244。

化合物H4的1H-NMR譜數據(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ8.00(1H,d,J=8.1 Hz)為一個烯氫信號,δ5.90(1H,d,J=4.7 Hz),5.70(1H,d,J=8.1 Hz)可能為烯氫信號或者酰胺鍵中與N相連的質子信號,δ4.27(2H,d,J=7.7 Hz),4.26(1H,d,J=7.8 Hz),4.15(1H,s,J=5.1 Hz)可能為烯氫信號或者羥基上的質子信號,δ3.87(1H,dd,J=9.6,7.1 Hz),3.83(2H,d,J=12.3,2.4 Hz),3.75(3H,m)。化合物H4的13C-NMR譜數據(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ164.79,151.09處的碳信號為羰基碳的信號特征,δ141.35,102.70,101.33為雙鍵碳信號,與1H-NMR譜中的烯氫信號相對應,δ89.38,84.97,69.91,60.92為-O-CH2-中的碳信號。

據上述分析,并與標準圖譜以及Mantsch H H等[18]報道的尿苷的譜圖數據基本吻合,由此確定化合物H4為尿苷(Uridine),分子式為C9H12N2O6,結構式如圖6。

圖6 化合物H4的化學結構式Fig.6 Chemical structure of compound H4

尿苷是一種核苷,其具有治療多種疾病的潛在作用。張珂等[19]研究發現,短期使用尿苷可以阻止一些藥物引起的脂肪肝,但長期使用會加劇脂肪肝的形成。此外,尿苷還可作為抗病毒抗腫瘤藥物的中間體[20],具有極其重要的醫藥價值,已廣泛應用于醫藥行業。

2.3.5 化合物H5的結構鑒定 化合物H5為無色片狀結晶,由質譜譜圖得出ESI-MS(Negative mode):m/z=351[M+Cl]-,分子量為316。

化合物H5的1H-NMR譜數據(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ7.96(1H,d,J=1.1 Hz),6.31(1H,d,J=16.6 Hz)為烯烴或者芳烴上的質子信號,δ5.57(s,2H),5.39(t,1H,J=7.2 Hz),5.25(t,1H,J=6.9 Hz)為烯氫信號指示,δ3.82(s,3H),δ3.46(d,2H,J=7.2 Hz)為與O或者鹵素相連飽和碳上的質子信號,δ2.34(m,2H)可能為一個炔烴上的質子或者與N、S、C=O、-Ar相連的碳上的一個質子信號,δ1.93(m,2H),1.78(s,3H),1.62(s,3H),1.30(s,3H)為-C=C-CH或者-C≡C-CH質子信號;化合物H5的13C-NMR譜數據(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ172.84,166.42為羰基碳的碳信號,δ152.88,145.06,135.06,132.55,124.54,123.31,116.01,103.62,96.27為雙鍵碳信號特征,δ71.56,56.78為-O-CH2-中的碳信號特征,δ39.39,27.31,25.22,21.65,17.80,16.04。

據上述數據分析,并與Ueda K等[14]、Cordes J等[21]報道的從猴頭菇中提取得到的異苯并呋喃酮衍生物Hericenone J的譜圖數據基本吻合,由此確定化合物H5為Hericenone J,其分子式為C19H24O4,結構式如圖7。

Hericenone J為猴頭菇子實體的次生代謝產物,屬于異苯并呋喃酮衍生物,研究表明其具有一定的刺激內源性神經生長因子(NGF)表達的活性[21]。

圖7 化合物H5的化學結構式Fig.7 Chemical structure of compound H5

3 結論

猴頭菇中富含多種生物活性成分,從其子實體乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相中提出分離并鑒定出油酸、Hericenone I、正二十九烷、尿苷、Hericenone J。其中Hericenone I與Hericenone J為猴頭菇子實體的次生代謝產物,屬于異苯并呋喃酮衍生物,據報道它們均有一定的刺激內源性神經生長因子(NGF)表達的活性[21],Hericenone I還被證實對人食管癌EC109細胞具有一定的細胞毒性[15],這可能是因為其具有與霉酚酸相近的結構,這些都顯示了其作為猴頭菇活性成分的功能活性及作為功能性食品開發應用的意義和潛力。尿苷是一種核苷,具有治療多種疾病的潛在作用,如可阻止脂肪肝[19]以及作為抗病毒抗腫瘤藥物的中間體[20],具有極其重要的醫藥價值。本文為猴頭菇活性成分的研究提供了理論依據,對其開發及應用有重要意義。