大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物的特性對植脂末乳化穩定性的影響

梁貴江,曾茂茂,何志勇,秦 昉,陳 潔

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學食品安全國際合作聯合實驗室,江蘇無錫 214122)

大豆蛋白作為一種常見的植物性蛋白,因其營養價值很高,同時價格低廉,從而成為人類重要的營養來源和工業原料。它具有乳化性、起泡性、凝膠性、熱穩定性等重要性質,可用來制造傳統食品及新型食品,使這些產品具有良好的組織結構及外觀。植脂末是一種利用微膠囊技術將油脂用水溶性壁材包埋形成的粉末狀產品,其具有制作工藝簡單、穩定性好、營養豐富等特點,因而被廣泛應用于配方奶粉、固體飲料、冰淇淋等食品體系中。

大豆分離蛋白(SPI)的乳化性質在許多食品中已有應用,但與食品工業中常用的酪蛋白酸鈉相比,其乳化活性和乳化穩定性與酪蛋白酸鈉相差甚遠。提高大豆蛋白的乳化性,使其能夠在植脂末等體系中應用,是大豆蛋白改造的一個熱點方向之一。大量研究發現,結構改造例如大豆蛋白組分分離、熱變性、有限水解等有利于提高大豆分離蛋白的乳化性[1-3]。報道顯示,7S蛋白的乳化性質明顯好于11S蛋白[4],7S蛋白疏水性較大,分子量較小,形成的乳狀液比11S蛋白更加穩定[5-6]。研究發現,熱處理過程中蛋白濃度、加熱溫度及時間對產物的結構和功能性質有很大影響,當熱處理溫度大于85 ℃時,大豆蛋白溶液經過短時間熱處理后產物乳化性質提高[7]。木瓜蛋白酶等酶處理對大豆蛋白進行酶解,酶解產物的乳化能力和乳化穩定性明顯提高[8]。胃蛋白酶由于在酸性條件下可以選擇性水解11S蛋白,保留高表面活性的7S,11S水解產物也具有一定的表面活性,這種組合被認為有助于提高水解產物的乳化性[9]。然而,迄今為止,很少有人研究大豆分離蛋白和不同酶水解方式對其酶解產物乳化性以及在實際體系應用中的效果。

本論文對比研究了大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物的組成和乳化性,并探討了大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物分別制備植脂末產品的微觀結構以及乳狀液穩定性。旨在為食品工業開發低成本、乳化性好的植脂末產品提供一定的理論和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東北大豆 黑龍江慶美種業有限公司;胃蛋白酶(3000 U/mg)、木瓜蛋白酶(2000 U/mg)生工生物工程(上海)股份有限公司;30%聚丙稀酰胺溶液(29∶1)、四甲基乙二胺(TEMED)、Nile Blue、Nile Red和考馬斯亮藍R250 Sigma-Aldrich公司;正己烷、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、過硫酸銨、正己烷、無水乙醇、甲醇、冰乙酸和甘油 國藥化學試劑有限公司。

JZ7114型粉碎機 上海朝陽微電機廠;RW20D型攪拌器、IKAT18型高速乳化均質機 德國IKA實驗技術公司;UV-2800H型紫外可見光分光光度計 尤尼柯(上海)有限公司;Avanti J-26 XP高速離心機 美國Beckman公司;LGJ-25C型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;601超級恒溫水浴 江蘇金壇市新航儀器廠;Mini-PROTEAN 3 Cell凝膠電泳儀 美國 Bio-Rad公司;TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡 德國Leica公司;ATS AH-basic高壓均質機 加拿大ATS公司;S3500激光粒度分析儀 美國Microtrac公司;Nano-ZS動態光散射儀 英國 Malvern公司;B-290小型噴霧干燥機 瑞士步琦(Buchi)公司;掃描電子顯微鏡(SU1510型) 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白(SPI)的制備 將大豆去皮、粉碎,在豆粉中加入3倍質量的正己烷攪拌浸提2 h,抽濾后得到脫脂豆粉。根據Puppo等[10]的方法用脫脂豆粉制備大豆分離蛋白(SPI)。脫脂豆粉加入蒸餾水(1∶10,w/v),使用2 mol/L NaOH將分散體調節至pH8,在室溫下攪拌2 h,離心(10000×g,20 min)。用2 mol/L HCl將上清液調節至pH4.5靜置30 min并離心(3300×g,10 min)。將離心獲得的沉淀用蒸餾水(1∶5,v/v)復溶,并用2 mol/L NaOH調節至pH7.0,冷凍干燥即為大豆分離蛋白。

1.2.2 大豆分離蛋白(SPI)水解產物的制備 參照李偉偉[11]的方法,將大豆分離蛋白(SPI)溶于水,溶液濃度調節至7%(w/v),用2 mol/L HCl將SPI溶液調節至pH2.0,并在37 ℃下保溫30 min。然后,將0.8%(w/w)的胃蛋白酶加入到溶液中,開始酶水解反應,在37 ℃下酶解3 h。通過用2 mol/L NaOH調節pH至7.0來終止反應,120 ℃加熱20 s滅酶滅菌,冷卻后用3300×g離心10 min,收集上清液即為水解產物,該產物用HPE表示。

將大豆分離蛋白(SPI)溶于水,溶液濃度調節至7%(w/v),調節 pH7.0,并在55 ℃下保溫30 min,然后加入0.5%(w/w)木瓜蛋白酶,進行酶反應,反應過程中利用0.2 mol/L的 NaOH 溶液滴定來控制pH至7,酶解1 h后,沸水浴加熱10 min終止反應,冷卻后3300×g離心10 min,收集上清液即為水解產物,該產物用PA表示。

1.2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 根據Liu等[12]的方法測定蛋白樣品(SPI、HPE、PA)的電泳亞基組成,其中濃縮膠濃度4%,分離膠濃度12%,pH8.0 樣品緩沖液,含有0.01 mol/L Tris-HCl,2% SDS,10%甘油和0.02%溴酚藍。調節蛋白樣品濃度為2 mg/mL,與等體積樣品緩沖液混合,沸水浴加熱3 min,冷卻,上樣量20 μL至上樣槽,電泳結束后取出凝膠染色并脫色,用凝膠成像儀拍攝圖片,并做電泳條帶掃描分析。

1.2.4 分子量分布測定 參照He等[13]的方法,用高效液相色譜法來測定蛋白樣品(SPI、HPE、PA)的分子量分布,使用KW-804蛋白凝膠柱(排阻極限106Da)和紫外檢測器(檢測波長280 nm)。流動相是0.05 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液(含0.3 mol/L的NaCl),洗脫速率為1 mL/min。細胞色素c(12 kDa)、碳酸酐酶(29 kDa)、白蛋白(66 kDa)、醇脫氫酶(150 kDa)、淀粉酶(200 kDa)和甲狀腺球蛋白(669 kDa)作為分子量標記用于校準曲線。樣品濃度均為10 mg/mL,取10 μL進樣分析。以出峰時間為橫坐標,分子量取對數為縱坐標,標準曲線的方程為y=-0.4708x+6.6162,R2=0.9856。

1.2.5 乳化活性和乳化穩定性的測定 乳狀液的制備 用待測樣品蛋白(SPI、HPE、PA)濃度調節為5 mg/mL,再與大豆油以4∶1體積混合,用分散器13500 r/min分散2 min。在離燒杯底部0.5 cm處取20 μL新鮮制備的乳狀液,加入到5 mL 0.1% SDS溶液中,混合均勻后在500 nm處測定吸光值,記為A0,乳狀液靜置30 min后采用相同的方法測定吸光值,記為A30,用0.1% SDS溶液作空白對照。根據Molina和Guo等人[14-15]的方法,乳化活性指標(EAI)和乳化穩定性指標(ESI)按照如下公式進行計算:

EAI(m2/g)=(2×T×A0×N)/[c×Φ×104];

ESI(%)=A30/A0×100

其中,T=2.303,N為稀釋倍數,c為乳狀液形成前蛋白質的濃度(g/mL),Φ為乳狀液中油相的體積分數,Φ=25%。

1.2.6 植脂末的制備 主要原料為SPI、HPE、PA、氫化椰子油、葡萄糖漿和水。其中,蛋白含量8%(w/w),油脂含量為30%(w/w),葡萄糖含量為22%(w/w),純水含量40%(w/w)。用分散器13500 r/min分散2 min,再經過高壓均質機均質兩遍,均質壓力為30 MPa,最后進行噴霧干燥。噴霧干燥條件:進口溫度180～200 ℃,出口溫度90～95 ℃。

表1 大豆分離蛋白及其水解產物分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of SPI and its hydrolysates

1.2.7 掃描電子顯微鏡 參照李偉偉[11]的方法,利用掃描電子顯微鏡觀察植脂末粉末的微觀結構,通過對顆粒的形狀、分布進行分析,加速電壓為5 kV,放大倍數1200倍。

1.2.8 共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM) 將制好的植脂末復溶于60 ℃的熱水,配制2%(w/v)植脂末溶液,參照Zhang等人[16]的方法,將20 μL熒光染料(0.1% Nile Blue,0.01% Nile Red,乙醇配制)加入到 5 mL的植脂末溶液中,取10 μL乳狀液滴到載玻片上,蓋上蓋玻片,指甲油密封,避光保存,用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察乳狀液的微觀結構,激發波長為633 nm。

1.2.9 平均粒徑和ζ-電位的測定 參照程宇[17]的方法,將制好的植脂末復溶于60 ℃的熱水,配制2%(w/v)植脂末溶液,樣品用10 mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液稀釋到濃度為0.001 wt%,采用激光粒度分析儀的Bluewave模式和馬爾文Nano ZS型動態光散射儀的SOP模式分別測定樣品的平均粒徑和ζ-電位。

1.2.10 咖啡穩定性測試 將制好的植脂末粉末加入到200 mL的1%濃度的咖啡溶液中,其中混合溫度為75 ℃,植脂末粉末與咖啡粉的比例為1∶2,分別觀察0 h和放置24 h后的咖啡溶液的穩定性。

1.3 數據分析

每個樣品設三個重復,采用Statistix 9.0軟件對實驗數據進行處理和分析,以P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物的亞基組成

圖1為大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物亞基的組成。7S蛋白主要由α′,α和β三種亞基組成,11S蛋白主要由酸性亞基A和堿性亞基B組成。從電泳圖可以看出,原始大豆蛋白大分子聚集體含量比較高,AB亞基聚集體含量也比較高;胃蛋白酶優先水解11S蛋白,胃蛋白酶水解產物中保留更多7S蛋白,同時產物中還保留了部分堿性亞基;木瓜蛋白酶水解產物主要為小部分堿性亞基條帶和大量的小分子肽。

圖1 大豆分離蛋白及其水解產物亞基組成的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE patterns ofSPI and its hydrolysates subunits注:MW:分子量標記(Da);α′(86 kDa),α(66 kDa)和β(51 kDa);A,酸性亞基(34～43 kDa),B,堿性亞基(17～26 kDa)。

2.2 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物的分子量分布

表1表示大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物的分子量分布。分子量分布與電泳結果比較吻合,SPI有少量聚集體,大部分的分子量集中在100～669 kDa,這個區間分布的主要是7S蛋白和11S蛋白。HPE只剩下7S蛋白,堿性亞基和小分子多肽,分子量主要集中在100～669 kDa和小于10 kDa。PA只剩下小部分堿性亞基和大量的小分子肽,分子量大部分集中在10 kDa以下區間。

2.3 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物的乳化活性和乳化穩定性

圖2表示大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物的乳化活性和乳化穩定性。從圖2可知,HPE的乳化性質均比SPI有顯著提高(P<0.05),乳化活性和乳化穩定性分別提高了22.7%和14.1%,而PA的乳化活性大幅度提高,但乳化穩定性顯著低于SPI(P<0.05),乳化穩定性下降了17.6%。SPI的乳化活性較差,這是可能由于SPI中11S蛋白是由二硫鍵連接酸性亞基和堿性亞基而成的六聚體[18],結構緊湊,分子量較大,蛋白分子靈活性和表面疏水性較低,蛋白分子吸附到水-油界面上的速度慢,降低界面張力的能力弱。蛋白吸附到油-水界面的速度越快,并在界面上展開、重排和暴露疏水集團的能力越大,乳化活性就越強,乳化穩定性則與蛋白能否在油滴外圍形成強度較大的剛性結構有關[19]。HPE乳化活性大幅度提高可能是由于其組成主要7S和堿性亞基,11S被水解后,蛋白的緊密結構展開、分解,促使疏水性基團的暴露,增加小分子量多肽,提高了分子靈活性,蛋白質分子能更迅速轉移至油-水界面,有效降低表面張力,且大量存在的7S蛋白和堿性亞基可以在油滴外圍形成高強度的剛性結構,有利于乳化穩定性的提高。PA的7S和11S蛋白都水解后,水解會釋放出疏水基團,增加蛋白疏水性,有利于乳化性的提高,但由于小分子肽含量過多,分子量過小的蛋白在油-水界面無法形成剛性結構,所以乳化穩定性較差,形成的乳狀液不穩定[20]。

圖2 大豆分離蛋白及其水解產物的乳化活性和乳化穩定性Fig.2 Emulsifying activity and emulsionstability of SPI and its hydrolysates注：對于同一測定指標，不同字母表示差異顯著(P<..05)。

2.4 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物對植脂末粉末及植脂末復水后乳液微觀結構的影響

圖3表示大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物對植脂末粉末微觀結構的影響。從圖3可以看出,SPI和PA制備的植脂末顆粒粘結聚集現象較嚴重,而用HPE制備的植脂末顆粒都是球形,壁材完整,基本沒有粘結聚集現象發生,顆粒分布較為均勻,這將有利于粉末在水中進行分散。

圖3 植脂末粉末的掃描電子顯微鏡圖Fig.3 SEM pattern of non-dairy creamer powder注:(a)SPI;(b)HPE;(c)PA。放大倍數1500倍。

圖4表示大豆分離蛋白不同酶法水解產物對植脂末復水后乳液微觀結構的影響。從圖4可以看出,SPI形成的乳狀液粒徑較大,且容易發生絮凝和液滴聚集,這與Chen等報道的類似[21]。HPE形成的乳狀液液滴很小,且分布均勻,沒有發生絮凝,這與其很好的乳化活性和乳化穩定性非常吻合。PA形成的乳狀液液滴雖然有少量的聚集,但優于SPI形成的乳狀液,這也與PA乳化活性優于SPI但不如HPE的性質相吻合。

圖4 復水乳液的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.4 CLSM pattern of emulsion after rehydration emulsion注:(A)SPI;(B)HPE;(C)PA。

圖5 復水乳液的平均粒徑和ζ-電位Fig.5 Average particle size andζ-potential of rehydration emulsion注:對于同一測定指標,不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物對植脂末復水后乳液的平均粒徑和ζ-電位的影響

圖5表示大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物對植脂末復水后乳液的平均粒徑和ζ-電位的影響。將制成的植脂末溶液放置0 h和6 h分別測量乳狀液平均粒徑的變化,復水后乳液HPE的平均粒徑最小(SPI>PA>HPE),且6 h后的平均粒徑幾乎無變化,說明形成的乳狀液很穩定。而SPI和PA的乳狀液粒徑6 h后變化較大,說明乳狀液穩定性較差。復水乳液0 h和6 h后HPE的ζ-電位絕對值最大(HPE>PA>SPI),ζ-電位絕對值越高,粒子間排斥力越大,乳狀液體系穩定性越高[22],ζ電位結果也進一步說明HPE形成的乳狀液最穩定。

2.6 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產物制備的植脂末對咖啡穩定性影響

圖6表示大豆分離蛋白及其不同酶法酶解物制備的植脂末對咖啡穩定性影響。將不同酶法水解產物制備的植脂末加入熱咖啡中,24 h后SPI最上層出現少量白色懸浮物,而HPE和PA呈現穩定的均一狀態,上述結果暗示,兩種酶解物可以有效提高產物乳化活性,未來可用于液態或者粉末態咖啡伴侶等體系的應用。

圖6 植脂末加入咖啡中的穩定性Fig.6 Stability of adding non-dairy cream to coffee注:從左到右依次是SPI,HPE,PA。

3 結論

SPI胃蛋白酶水解產物中含有較多7S蛋白和小分子多肽,乳化活性和乳化穩定性比SPI均有顯著提高;而木瓜蛋白酶水解物含有少量堿性亞基和大量小分子多肽,乳化活性比SPI顯著提高但乳化穩定性顯著下降;制備的植脂末微觀結構和植脂末溶解后乳狀液的微觀結構也進一步證實了SPI胃蛋白酶水解產物制備的產品具有最好的乳化效果,咖啡穩定性結果顯示,兩種酶解物均可用于咖啡伴侶。如果酶解物中存在過多小分子肽,盡管分子柔性增加有利于界面快速成膜從而提高乳化活性,但由于難以形成剛性膜、界面膜強度不足,會不利于乳化穩定性;如果能夠保留相對較多的7S蛋白和堿性亞基,則有助于形成更高強度的界面膜,從而使得乳化活性和乳化穩定性同步提高,從而有利于乳狀液更加穩定。本研究為大豆蛋白在植脂末產品以及其他高乳化性需求產品中的應用提供了基礎。