高壓均質處理對不同濃度肌原纖維蛋白水懸液理化特性及蛋白結構的影響

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(1.南京農業大學食品科技學院,國家肉品質量安全控制工程技術研究中心,江蘇南京 210095;2.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心,江蘇南京 210095;3.山東省煙臺市東方海洋科技股份有限公司,山東煙臺 246003)

肉類蛋白營養豐富,包含人類所需的所有必需和非必需氨基酸,其消化率遠高于大豆蛋白等植物蛋白,屬于優質的人體蛋白質補充劑[1-2]。肌原纖維蛋白(Myofibrillar proteins,MP)是肌肉蛋白中最主要的蛋白質,大約占肌肉蛋白的50%左右[3]。一般認為,MP屬于鹽溶性蛋白,僅在高鹽濃度下有較高的溶解性,在水溶液中溶解性差[4]。在肉品加工中,MP溶解性直接影響產品加工特性,如粘結性、乳化性和凝膠型等[5-6]。因此,MP溶解性是開發新的配方和肉類產品一個重要的功能特性。由于肉類蛋白在水或者低離子強度溶液條件下中微溶或不溶解,因此相比于牛奶和植物蛋白等而言,肉類蛋白在食品加工中利用程度相對較低,產品形式單一,提高肉類蛋白在水或者低離子強度溶液中的溶解度很有必要。

為了提高肉類蛋白的利用程度,開發其加工潛力,許多研究人員嘗試利用不同的方法,如超聲波[7]、蛋白糖基化[8-9]和低鹽洗脫[10]等新技術來改善MP的溶解性,但是由于這些方法步驟繁瑣,并且容易引起加工特性劣變,故在工業生產中受限。高壓均質(High pressure homogenization,HPH)是一種新型的食品加工技術,此項技術已經被研究應用于生物、醫藥、食品、化工等行業。在高壓作用下,流體物料通過具有特殊內部構造的均質腔,同時受到高速剪切,高頻震蕩、空穴作用和對流碰撞等物理作用,從而起到很好的超微化、微乳化、均一化和殺菌的效果[11-13]。理論上,通過HPH的物理作用能夠打破MP高度交聯的復雜結構,對MP進行物化改性,能夠實現MP的水溶性。已有研究表明,不同次數和壓力的HPH處理可以對植物蛋白的蛋白結構[14-17]、理化特性產生不同的影響,從而提高植物蛋白在食品加工中的利用程度[18-20]。在前期研究中[13],發現對5 mg/mL的MP懸濁液進行103 MPa、2次HPH處理,能夠打破MP高度有序的復雜結構,改變MP的理化特性,從而改善MP的水溶性。蛋白質是一種人體營養的重要補充來源,而蛋白濃度是食品加工中的一項重要理化指標,蛋白濃度的不同會影響體系中的凝膠特性、溶解性和乳液穩定性等加工特性。5 mg/mL濃度的MP水懸液并不能滿足食品加工的需要,同時,當MP在水中的濃度提高時,HPH處理對不同濃度的MP在水中的溶解性的影響以及其調控規律還尚不清楚,開展HPH對不同濃度MP水懸液溶解性的調控規律研究很有必要。

在前期研究的基礎上,為了使MP達到較好的HPH處理效果,本實驗通過103 MPa壓力下,4次HPH循環分別對5、10、15 mg/mL的MP水懸液進行處理,對處理后的MP水懸液溶解性、穩定性、粒徑、流變特性、二級結構和三級結構的變化進行測定,探究HPH處理對不同濃度MP理化性質及結構的影響和規律,以期為肉蛋白的在食品中的進一步開發利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍雞胸肉 江蘇省南京市蘇果超市;羥甲基氨基甲烷(Tris base)、鹽酸、牛血清蛋白(BSA)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、氫氧化鈉、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)等(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

GM 200粉碎儀 德國Retsch儀器有限公司;T25勻漿機 德國IKA儀器有限公司;Mini Debee超高壓均質機 美國Bee儀器有限公司;Z5(130 μm)金剛石噴嘴 美國Genizer儀器有限公司;J26SXP落地式離心機 美國Beckman儀器有限公司;Nano ZS 90納米激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司;MCR 301流變儀 澳大利亞Anton Paar有限公司;Dimension Icon原子力顯微鏡 美國Bruker有限公司;Imager Scanner III EU-88 掃描儀 日本Epson公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白(MP)的提取 根據Stefansson等[10]的方法稍作修改,采用水洗法提取肌原纖維蛋白。取冷凍雞胸肉在4 ℃下放置12 h解凍,隨后去除其結締組織和脂質。將雞胸肉放入粉碎儀,以3000 r/min的速度處理10 s,用去離子水將肉糜(100 g)混合,洗滌四次,每次洗滌前用勻漿機均質2 min。將每次洗滌后的肉糜與水(1∶100,W/V)混合,靜置10 min,以18000×g轉速離心20 min,收集沉淀物,在第三次洗滌后,將離心前的懸濁液用三層紗布過濾,以去除多余的結締組織和脂質。最后一次洗滌、離心后,沉淀物即為肌原纖維蛋白(MP)。所有操作均在4 ℃條件下進行。

1.2.2 高壓均質(HPH)處理 用雙縮脲法測定提取后的MP濃度為60 mg/mL,用去離子水將MP濃度稀釋至5、10、15 mg/mL備用,用勻漿機在8000 r/min轉速下處理6次,每次處理20 s,每次間隔10 s。用配備有Z5型號噴嘴的超高壓均質機將樣品在4 ℃、103 MPa壓力下進行循環4次HPH處理,以未經過HPH處理的樣品為對照組。處理后將所有樣品裝入無菌袋保存,為了防止微生物污染對實驗結果產生影響,添加0.02%的疊氮化鈉(NaN3)作為防腐措施[21],所有樣品于4 ℃冰箱存儲備用。

1.2.3 溶解度的測定 參考Chen等[13]的方法,并作修改。將經過處理后的樣品在4 ℃條件下,在20000×g轉速下離心20 min,離心后收集上清液,用雙縮脲法測定離心后的上清液蛋白濃度和離心前MP懸濁液蛋白濃度。溶解度以離心后的上清液蛋白質濃度相對于離心前MP懸濁液蛋白濃度的百分比表示,溶解度計算公式為:

1.2.4 穩定性的測定 將經過HPH處理后的MP水懸液在4 ℃條件下放置9 d,在第0、3、6、9 d分別測定其溶解度并進行記錄,每個樣品平行測定3次。

1.2.5 粒徑分布的測定 根據Chen等的方法[13],并作修改。使用Nano ZS 90納米激光粒度儀對MP在水中的粒徑進行測定。將5、10、15 mg/mL的MP水懸液濃度同時稀釋至0.5 mg/mL,置于1 cm光程石英比色杯中,在25 ℃條件下進行測量,從而得到平均粒度(Z-average)和粒徑分布。

1.2.6 流變特性的測定 使用MCR30流變儀對經過HPH處理后的MP水懸液的流動特性進行測定[25]。測量間距0.5 mm,測量前將樣品在流變儀上平衡30 s,以獲得25 ℃的理想溫度,記錄隨著剪切速率從1 s-1升高到1000 s-1的范圍內時粘度的變化曲線。

1.2.7 表面疏水性的測定 根據Zhong等[26]、Cao等[27]的方法并作修改,對經過HPH處理后的MP在水中表面疏水性的進行測定,使用8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)測試表面疏水性。向2 mL樣品(去離子水稀釋至1 mg/mL)中加入10 μL 15 mmol/L ANS溶液(0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH7.0)。在避光條件下,孵育20 min;使用380 nm的激發波長和410～570 nm的發射波長在5 nm/s掃描下測定其熒光強度。表面疏水性表示為熒光強度(任意單位,a.u.)。

1.2.8 活性巰基含量的測定 根據Chen等[28]的方法并進行修改,測定MP在水中的活性巰基(SH)含量。將經過HPH處理后的MP水懸液用去離子水稀釋至1 mg/mL,將50 μL DTNB溶液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液,pH8.0)中加入4 mL樣品(1 mg/mL),并在25 ℃條件下孵育20 min,通過Microplate Reader分光光度計在412 nm測定混合物的吸光度。使用13600 M-1·cm-1的摩爾消光系數計算巰基的含量,每個壓力水平重復試驗三次。巰基濃度(μmol/100 mg)的計算公式為:

式中:A412為吸光度;D為稀釋倍數;C蛋白為肌原纖維蛋白濃度。

1.2.9 圓二色譜(CD)分析 使用Jasco J-715分光偏振計進行圓二色譜(CD)測定。將經過HPH處理后的MP水懸液稀釋至0.3 mg/mL,隨后轉移至0.1 cm光徑的石英皿中。在調節溫度下以20 nm/min的掃描速率在200～240 nm的范圍內測量分子橢圓率。使用Jasco J-715旋光偏振計提供的蛋白質二級結構計算程序測定樣品二級結構的百分比。

1.3 數據分析

所有數據均重復實驗3次,數據統計使用SAS軟件,單因素方差分析分析組間差異性,P<0.05為顯著差異。采用Origin 2017軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 HPH處理對不同濃度MP水懸液溶解性的影響

由圖1可知,未經過HPH處理的樣品,溶解度較低(23.49～31.77%),MP在水中的溶解性較差[26],并且不同濃度MP水懸液的溶解度之間沒有顯著性差異(P<0.05),說明濃度的不同對未經HPH處理的MP在水中的溶解性沒有明顯影響。經過HPH處理后,不同濃度MP水懸液的溶解度均顯著提高(P<0.05),其中濃度為5 mg/mL的MP水懸液溶解性最好,達到88.39%,這與Chen等[13]的研究結果相符。物料在經過HPH時,會受到高速剪切、空穴作用、對流撞擊等機械作用,MP蛋白分子結構展開,疏水基團更多地暴露出來,導致表面電荷增加,從而提高其溶解性。隨著MP水懸液濃度的增加,觀察到MP水懸液的溶解度顯著降低(P<0.05),說明MP水懸液的濃度越高,經過HPH處理后,MP在水中溶解的效果越差,造成這種現象的原因可能是由于當高濃度的MP懸濁液通過HPH作用腔時,由于蛋白質密度較大,蛋白質在均質腔中直接碰撞概率大大提高,容易形成蛋白質聚集,影響其溶解性。

圖1 HPH處理對不同濃度水懸液中MP溶解性的影響Fig.1 Effect of HPH treatment on MP solubilityin water suspensions with different concentrations注:不同上標字母表示同一指標存在顯著性差異(P<0.05);C-5:Control,5 mg/mL;C-10:Control,10 mg/mL;C-15:Control,15 mg/mL;5:HPH處理,5 mg/mL;10:HPH處理,10 mg/mL;15:HPH處理,15 mg/mL。圖3、圖7同。

2.2 HPH處理對不同濃度MP水懸液穩定性的影響

將經過HPH處理后的MP水懸液進行為期9 d的儲藏,每隔3 d測定樣品溶解度,得到不同濃度MP水懸液溶解度的變化如圖2所示。由圖2可知,未經過HPH處理的MP水懸液在貯藏期間一直保持著較低的溶解度,隨著貯藏時間的延長,沒有顯著性變化(P>0.05)。經過HPH處理后,不同濃度MP水懸液的溶解度均顯著提高(P<0.05)。處理濃度為5 mg/mL的MP水懸液溶解度顯著高于其他處理濃度(P<0.05),在0～6 d時溶解度無顯著性變化(P>0.05),在6～9 d時顯著降低(P<0.05),在第9 d時,5 mg/mL的溶解度為79.08%;處理濃度為10 mg/mL的MP水懸液溶解度在第0～9 d時顯著下降(P<0.05),處理濃度為15 mg/mL的MP水懸液在第3 d時的溶解度與0 d時相比顯著下降(P<0.05),3～6 d無顯著性變化(P>0.05),在第9 d時顯著低于第3 d(P<0.05)。研究表明,處理濃度為5 mg/mL的MP水懸液經過103 MPa、2次HPH的處理后溶液的均一性得到顯著改善,同時在14 d的貯藏過程中幾乎不會產生蛋白質沉淀現象[13,27-28],與本研究結果一致,這是由于當蛋白濃度較低時,水懸液的流動性更強,可以用更快的速度通過HPH均質閥,破碎更為完全,顆粒分布更加均勻,從而提高其穩定性。但是,當MP的濃度增加時,MP水懸液中的蛋白質密度也隨之增加,物料通過HPH均質腔時,剪切、碰碰撞等機械作用對蛋白質分子的破壞不完全,導致蛋白質分子在水懸液中分散不均勻,從而在貯藏過程中聚集、沉淀,使MP水懸液穩定性下降[14,29-30]。

圖2 HPH處理對不同濃度MP水懸液穩定性的影響Fig.2 Effect of HPH treatment on stability ofMP water suspension with different concentrations注:不同上標字母表示同一指標存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 HPH處理對不同濃度MP水懸液粒徑的影響

HPH處理對不同濃度MP水懸液粒徑的影響如圖3和圖4所示。由圖3可知,與經過HPH處理的樣品相比,未經處理的樣品具有更大的粒徑[16]。MP水懸液濃度越高,粒徑越大,說明溶液中蛋白的粒徑大小隨著MP水懸液濃度的提高而顯著增加(P<0.05)。經過HPH處理后,各處理組MP水懸液的粒徑顯著降低(P<0.05),其中5 mg/mL的MP水懸液粒徑最低(263.4 nm)。與之相比,經過處理后的10、15 mg/mL MP水懸液具有較大的粒徑(P<0.05),分別達到366.3、400.7 nm,并且兩者之間沒有顯著性差異(P>0.05)。由圖4可知,隨著MP水懸液濃度的提高,粒徑分布峰有向大粒徑分布的趨勢,10、15 mg/mL的MP水懸液之間沒有明顯的區別。未經過HPH處理時,MP懸濁液中可能還存在一些高度有序狀態的肌原纖維蛋白,導致粒徑較大。MP懸濁液通過HPH均質腔,受到一系列剪切力、空穴作用、碰撞作用等機械力,蛋白質結構被破壞成更小的片段,導致粒徑減小。隨著MP濃度的增加,蛋白質在HPH均質腔中的相互作用加強,可能導致均質腔內部壓力上升,同時據研究報道,當壓力增加時,HPH處理比較容易使蛋白質產生聚集[19,31-32]。故高濃度的蛋白可能會影響HPH均質腔中壓力的作用效果,從而影響其粒度特性。

圖3 HPH處理對不同濃度水懸液中MP的Z-平均粒徑的影響Fig.3 Effect of HPH treatment on Z-average particle size ofMP in water suspensions with different concentrations

圖4 HPH處理對不同濃度MP水懸液粒徑分布的影響Fig.4 Effect of the HPH treatment on particle size distributionof MP water suspension with different concentrations

2.4 HPH處理對不同濃度MP水懸液流變特性的影響

MP水懸液的表觀粘度如圖5所示。結果表明,隨著剪切速率的增加,所有處理組的表觀粘度下降,呈現假塑性流體特征。經過HPH處理后,不同濃度樣品的粘度都較未處理之前有所下降,這與Chen等[13]和鐘俊楨等[20]的研究結果相符。5 mg/mL的處理組具有最低的粘度,與未處理之前相比,表觀粘度下降最為明顯;而15 mg/mL的處理組經過HPH處理后粘度變化幅度不大,同時隨著剪切速率的增加,表觀粘度逐漸與未處理的樣品接近。研究表明,蛋白分散體的流動行為可以受顆粒尺寸和尺寸分布以及顆粒形狀和顆粒變形性的影響[33-35],在未處理的樣品中具有高粘度、完整的肌原纖維蛋白片段,其中大的蛋白顆粒與大分子相互糾纏,增加了溶液流動的阻力[13]。在本研究中,5 mg/mL的MP水懸液經過HPH處理后粒徑最小,說明大部分蛋白結構都被破壞,具有較小的蛋白顆粒,所以表觀粘度較低,流動性較好。然而,在較高濃度(10、15 mg/mL)的MP水懸液中還存在著許多較大的、未被破壞的完整的肌原纖維蛋白片段以及蛋白質聚集體,這會導致粒徑的增加以及顆粒尺寸的分布不均,從而影響其流動能力。

圖5 HPH處理對不同濃度MP水懸液流變特性的影響Fig.5 Effect of HPH treatment on rheological properties ofMP water suspension with different concentrations

2.5 HPH處理對不同濃度MP水懸液表面疏水性的影響

MP水懸液表面疏水性的變化如圖6所示。未經HPH處理的樣品之間的表面疏水性沒有明顯區別,疏水基團含量較少。經過HPH處理后,不同濃度的MP水懸液的表面疏水基團明顯增加,其中處理后的15 mg/mL樣品表面疏水基團明顯少于5、10 mg/mL的樣品,并且5、10 mg/mL樣品之間差別不明顯。在HPH處理之前,疏水基團大多數緊密包埋在球狀區域內,與熒光探針的接觸受到抑制[32,36],導致疏水含量較低。在HPH處理的過程中,MP受到高靜壓、剪切力、碰撞等機械力作用,蛋白質發生去折疊現象,部分二硫鍵的產生被抑制,促進了蛋白質結構的展開,疏水基團暴露并且相互作用,從而導致表面疏水性的提高[29,31,37]。隨著濃度增加到15 mg/mL時,可能由于HPH處理過程中高濃度蛋白溶液中蛋白質更易發生聚集[37],使粒徑增大,同時這種聚集阻止了疏水基團的暴露,導致與5、10 mg/mL的樣品相比,疏水性較低。但是由圖3的結果發現,10、15 mg/mL的平均粒徑沒有顯著差異,這可能是因為濃度提高時,大部分疏水基團都包埋在了蛋白質分子之間,使疏水性較低。而5 mg/mL的樣品由于其粒徑較小,水懸液內部的顆粒分散更加均勻,HPH處理的強剪切力對蛋白質內部隱藏的疏水基團進行切割,更多的疏水基團暴露出來,導致疏水性增加明顯[32,41],蛋白質表面電荷發生改變,使水化作用增強,從而提高其溶解性[18,39]。

圖6 HPH處理對不同濃度MP水懸液表面疏水性的影響Fig.6 Effect of HPH treatment on surface hydrophobicity ofMP water suspension with different concentrations

2.6 HPH處理對不同濃度MP水懸液活性巰基含量的影響

巰基是MP中重要的功能基團,其含量變化反映了MP蛋白結構的改變[18]。MP水懸液的活性巰基含量變化如圖7所示。經過HPH處理后,不同濃度MP水懸液的活性巰基含量均顯著性增加(P<0.05),其中,5 mg/mL處理組的活性巰基含量(11.73 μmol/100 mg)顯著低于其他處理組(P<0.05),并且處理組的巰基含量隨著MP濃度的增加而增加。有研究表明,HPH處理時產生的劇烈機械作用會造成蛋白質結構的改變以及蛋白質的變性[40],同時,蛋白質分子展開后可能會誘導巰基以及疏水基團從蛋白質分子內部暴露出來,使活性巰基含量增加。當MP水懸液濃度較低時,蛋白質展開變得松散,蛋白質的表面積與體積之比增加,表面電荷分布增強,水化作用增強,因此增加了蛋白質的溶解性[41];同時,由于蛋白顆粒新形成的界面在熱力學上不穩定,導致巰基基團發生重折疊,使其包埋在蛋白質分子內部,隨后二硫鍵的斷裂和巰基的氧化、包埋形成對立面,使巰基的氧化和包埋占主導[22],所以MP濃度較低時,活性巰基含量較少。

圖7 HPH處理對不同濃度MP水懸液活性巰基含量的影響Fig.7 Effect of HPH treatment on active sulfhydryl content ofMP water suspension with different concentrations

2.7 圓二色譜(CD)分析

HPH處理對不同濃度MP水懸液的二級結構影響如表1所示。由表1可知,經過HPH處理后,所有處理組均呈現α-螺旋降低,β-折疊、β-轉角和無規卷曲結構增加的現象,5 mg/mL樣品的α-螺旋降低最為明顯。據文獻報道,HPH處理會誘導蛋白質部分結構的展開,且對結構改變起主導作用[17]。肌原纖維蛋白中α-螺旋的缺失可能導致分子間相互作用的變化,從而破壞蛋白組裝過程,導致MP在水中的溶解度增加[25]。在本研究中,當蛋白濃度為5 mg/mL時,蛋白質之間的作用力較小,從而導致其結構更易于展開,使溶解度增加。隨著濃度的提升,蛋白在HPH處理過程中受到的壓力可能也會隨之提高,而據研究表明[38],均質壓力提升會導致蛋白質之間相互作用加強,同時在疏水作用下,一部分蛋白質重新聚集、組裝,α-螺旋也會隨之增加。同時β-轉角被認為是蛋白分子排列有序的產物[38],說明經過HPH處理后,MP在水中的均勻性以及蛋白構象穩定性有所提升,而本研究中,經過HPH處理后所有樣品的β-轉角都有明顯提升,與相關研究結果一致。

表1 圓二色譜分析MP水懸液的二級結構組成Fig.1 Analysis of the secondary structural compositions ofMP water suspension by circular dichroism

3 結論

本文通過HPH處理不同濃度MP水懸液,并對其理化特性以及蛋白結構進行測定,發現在一定的濃度范圍內(5～15 mg/mL),HPH處理可以顯著提高不同濃度MP在水中的溶解性(最高達到88.39%),并且隨著濃度的增加,溶解效果呈現下降趨勢;處理后的樣品在4 ℃條件下放置9 d后仍然能保持最高79.08%的溶解度,具有較好的穩定性。同時,經過HPH處理的MP水懸液的分散性、流動能力等理化特性得到顯著提升,蛋白二、三級結構被破壞,處理效果隨著MP濃度的升高而下降。5 mg/mL的MP水懸液經過HPH處理后具有更好的水溶性,當濃度提高時,與5 mg/mL相比,10、15 mg/mL的MP水懸液的粒徑有增大的趨勢,造成樣品流動能力下降,同時疏水性下降,活性巰基含量上升,α-螺旋結構增加,這可能與高濃度MP在HPH處理時容易產生蛋白質的聚集有關。因此,HPH處理對MP在水中溶解性的改善效果隨著MP濃度的提高而降低,為新型低鹽肉制品的開發提供了新的思路,但是要實現較高濃度的MP在水中的溶解,還仍需進一步研究。