東莞地區非家族性低鉀型周期性麻痹患者外周血KCNJ18基因突變情況分析

楊媚，羅成宏，付倫姣，廖成鉅

(東莞市第三人民醫院，廣東東莞523326)

低鉀型周期性麻痹(HOKPP)是一種罕見的常染色體顯性遺傳性骨骼肌通道病，發作時伴有低鉀血癥，嚴重者可危及生命[1]。HOKPP患者多為青少年和年輕人(2～30歲)，可分為家族性和非家族性，二者癥狀相似，但后者不具有家族聚集性。非家族性HOKPP包括無家族發作史的甲亢性低鉀型周期性麻痹(TPP)、散發性周期性麻痹(SPP)[2]，其發病機制尚不明確。離子通道基因KCNJ18是編碼骨骼肌特異性內向整流K+(Kir)通道蛋白，既往研究顯示，中國山東地區人群KCNJ18與HOKPP的發病相關[2]。在非家族性HOKPP中，研究者對美國、巴西、法國、泰國和新加坡地區TPP患者血液樣本檢測，發現KCNJ18突變與TPP易感性和SPP的發病有關[3，4]。但中國人群KCNJ18與非家族性HOKPP的相關性尚不明確[5,6]。為此，本研究對東莞地區非家族性男性HOKPP患者的外周血樣本進行PCR擴增和Sanger測序，分析KCNJ18的突變情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017～2018年東莞市第三人民醫院收治的48例非家族性男性HOKPP患者(HOKPP組)，年齡18～68(36.15±2.82)歲。診斷標準：①急性肌無力(不能行走)；②發作時血清K+<3.5 mmol/L；③排除家族性HOKPP及利尿劑、瀉藥、激素等藥物引起的低鉀血癥。血清K+基礎狀態為(4.07±0.05)mmol/L、發作期為(2.60±0.07)mmol/L，促甲狀腺激素(TSH)為(0.84±0.15)mIU/L，游離三碘甲腺原氨酸(FT3)為(9.88±1.50)pmol/L，游離甲狀腺激素(FT4)為(30.29±3.37)pmol/L。另選擇男性健康體檢者30例作為對照組，排除甲狀腺功能亢進或HOKPP家族史。年齡20～62(36.43±2.12)歲，血清K+(4.00±0.06)mmol/L，TSH(1.44±0.17)mIU/L，FT3(4.77±0.15)pmol/L，FT4(16.95±0.36)pmol/L。兩組年齡、基礎狀態血清K+比較差異無統計學意義(P均>0.05)，HOKPP組TSH低于對照組而FT3、FT4高于對照組(P均<0.05)。本研究經醫院倫理委員會審核通過，受試者均知情同意。

1.2 外周血KCNJ18基因突變檢測方法

1.2.1 DNA提取 采集受試者外周血3 mL。按照AxyPrep血液基因組DNA小劑量制備試劑盒AxyPrep-96 DNA Extraction Kit(AxyPrep，美國)進行DNA提取。采用紫外分光光度計(DU-70，Beckman，美國)檢測DNA提取質量。

1.2.2 KCNJ18基因片段擴增與測序 采用PCR法進行基因片段擴增。使用軟件設計KCNJ18(GenBank：NG_042809.1)引物，上游：5′-ATGCTGTCCTCTCTGTTCC-3′，下游：5′-TGGCCGGGGAGAGGCCC-3′，目標產物長度1.4 kb。PCR反應條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性30 s；65 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，共28個循環；72 ℃延伸3 min。4 ℃保溫。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后使用PCR產物純化試劑盒AmpureXP(Beckman，美國)回收。將PCR產物送至上海生工公司，采用Sanger法進行雙向測序(3130DNA測序儀，Life Technologies，美國)，測序擴增采用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit試劑盒(Life Technologies，美國)。PCR產物測序結果使用Mutation Surveyor軟件進行突變位點分析(參考序列為NG_033093.1)。

2 結果

2.1 HOKPP組KCNJ18基因變異情況 HOKPP組共檢出5個新的KCNJ18突變位點，分別為G116A、G119A、C167A、A745G和G576C。5個位點均為錯義突變，分別導致R(精氨酸)突變為Q(谷氨酰胺)，R(精氨酸)突變為H(組氨酸)，A(丙氨酸)突變為E(谷氨酸)，Q(谷氨酰胺)突變為H(組氨酸)，I(異亮氨酸)突變為V(纈氨酸)。KCNJ18突變位點的Sanger測序鑒定見圖1。

注：箭頭所示為突變位點。

2.2 兩組KCNJ18基因5個位點的純合突變和雜合突變情況比較 比較G116A、G119A、C167A、A745G、G576C位點在HOKPP組和對照組中的頻率分布差異及氨基酸序列改變，結果顯示，5個位點純合突變在兩組中均有分布。對照組G116A、G119A、C167A、A745G的純合突變率均為100%，雜合突變均為0；HOKPP組G116A、G119A、C167A、A745G純合突變率均為66.7%，雜合突變率為33.3%。HOKPP組G116A、G119A、C167A、A745G雜合突變率高于對照組(P均<0.05)。

3 討論

目前認為，HOKPP的發生主要由遺傳因素引起。HOKPP可分為家族性和非家族性HOKPP，非家族性HOKPP包括無家族發作史的TPP和SPP，其中TPP繼發于高甲狀腺素血癥，是甲亢患者常見的并發癥。家族性和非家族性HOKPP擁有相似的表型[7]，提示二者可能存在相似的致病機制。研究證實，家族性HOKPP患者存在離子通道缺陷[8]。Ryan等[4]研究認為，TPP患者離子通道基因KCNJ18突變與TPP相關，提示KCNJ18基因突變可能與HOKPP相關。

在KCNJ18突變的相關研究中，TPP的KCNJ18突變報道較多。Li等[9]報道了TPP患者的3個新KCNJ18突變位點，并提出KCNJ18基因在中國大陸TPP患者中的突變攜帶率約為3.1%。Zheng等[3]報道，TPP患者中存在KCNJ18基因c.505G>C突變，該位點變異可導致G169R甘氨酸到精氨酸的錯義突變，從而導致細胞內外電流下降。Cheng等[10]報道，TPP患者KCNJ18的G502A突變可引起纈氨酸到甲硫氨酸的錯義突變。而SPP的KCNJ18突變情況目前報道較少。梅志忠等[5]報道，SPP患者中未檢測到KCNJ18突變位點。Cheng等[10]發現，SPP患者中的KCNJ18雜合突變可導致R43C和A200P氨基酸替換。本研究收集了東莞地區48例非家族性男性HOKPP患者的外周血樣本進行DNA測序，新發現4個KCNJ18突變位點。經查閱文獻，這4個位點均未收錄在人類基因突變及相關疾病數據庫中，為本研究首次報道。

本研究結果顯示，G116A、G119A、C167A和A745G的純合突變在HOKPP組和對照組中均有出現，提示這些純合突變可能為非致病性的多態性位點。同時，在對照組中未發現這4個位點的雜合突變，且位點的雜合突變與非家族性HOKPP相關，提示G116A、G119A、C167A和A745G雜合突變可能為致病性突變。目前KCNJ18突變的功能影響仍不清楚。Li等[9]報道，與無KCNJ18突變的TPP患者比較，KCNJ18突變患者肌肉無力的持續時間更短，肌肉酸痛或肢體麻木的癥狀更普遍，肌肉無力的復發率更高。KCNJ18基因G169R變異可導致人腎上皮細胞系293細胞內向和外向電流密度異常降低[3]。此外，KCNJ18基因G502A突變被發現可影響K+內流和外流[10]。因此，我們推測，KCNJ18位點的突變有可能與調節K+的內流和外流有關，具體的功能有待后續基于細胞和動物水平的KCNJ18位點突變的功能研究提供更多的證據。

對比不同地域非家族性HOKPP患者KCNJ18位點突變的情況，我們發現梅志忠等[5]檢測的廣東地區散發性HOKPP患者以及劉曉黎等[6]報道的上海地區漢族人群TPP患者中均未發現KCNJ18致病性相關突變位點。而Ryan等報道的美國、巴西、法國地區30例TPP患者中有5例存在KCNJ18突變，27例新加坡TPP患者中有7例，31例泰國TPP患者中沒有KCNJ18突變，83例中國香港患者中僅1例KCNJ18突變。提示非家族性HOKPP患者的KCNJ18突變頻率存在地區差異，歐美地區TPP患者KCNJ18突變率相對較高。而泰國、中國香港TPP患者幾乎未檢測到突變，可能與受試者樣本量較小有關。

綜上所述，我們在東莞地區非家族性男性HOKPP患者中新發現了KCNJ18的G116A、G119A、C167A、A745G、G576C錯義突變位點，其中G116A、G119A、C167A和A745G與非家族性HOKPP有關。未來KCNJ18位點突變的功能研究將進一步提供KCNJ18參與HOKPP疾病發生的證據。