腦梗死急性期患者外周血CD4+ T細(xì)胞PD-1表達(dá)變化與血清炎癥因子水平的關(guān)系

王瑋，馮筑生，李俊杰，牛軍，尹文

(1中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安710032；2中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第967醫(yī)院)

腦梗死的致死率、致殘率均很高，部分患者可出現(xiàn)永久性神經(jīng)功能障礙[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死能夠?qū)е旅庖咭种疲滓l(fā)細(xì)菌感染，腦梗死后感染的發(fā)生率為23%～65%，嚴(yán)重影響患者的神經(jīng)功能恢復(fù)和預(yù)后[3，4]。CD4+T細(xì)胞對腦梗死后免疫功能的維持具有重要作用，根據(jù)CD4+T細(xì)胞所處的成熟階段和免疫功能不同，其主要分為三個亞群，即初始T細(xì)胞(CD4+CD45RA+CCR7+T細(xì)胞)、記憶T細(xì)胞(CD4+CD45RA-CCR7+T細(xì)胞)和效應(yīng)T細(xì)胞(CD4+CD45RA-CCR7-T細(xì)胞)，對判定免疫功能具有重要意義，這三個亞群的百分比降低表示機(jī)體免疫功能下降。程序性死亡分子1(PD-1)是表達(dá)于T細(xì)胞表面的免疫調(diào)節(jié)分子，是免疫系統(tǒng)參與免疫功能調(diào)節(jié)的重要分子之一。PD-1及其配體是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵負(fù)性共刺激分子，PD-1與其配體結(jié)合后能夠使T細(xì)胞停滯于G0/G1期，從而抑制T細(xì)胞的生物學(xué)功能，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)程度[5]。而γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)是T細(xì)胞發(fā)揮免疫活性功能的重要炎癥因子，但PD-1與炎癥因子關(guān)系的研究報道較少。為此，本研究觀察了腦梗死急性期患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中PD-1表達(dá)及血清IFN-γ、TNF-α表達(dá)的變化，分析PD-1與血清炎癥因子的相關(guān)性，旨在明確腦梗死急性期免疫功抑制的病理機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年6月～2018年6月我院收治的腦梗死急性期患者30例(觀察組)，男18例、女12例，年齡46～75歲、中位年齡58歲，發(fā)病時間<24 h。納入標(biāo)準(zhǔn)：明確的突發(fā)性神經(jīng)功能障礙病史；經(jīng)頭顱CT或MRI檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他自身免疫性疾病；在過去的3個月中因其他疾病接受過免疫抑制劑治療；取血前4周內(nèi)出現(xiàn)過急性炎癥性疾病。另選擇性別、年齡相匹配的健康查體者30例作為對照組，男17例、女13例，年齡48～74歲、中位年齡59歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 外周血的采集和PBMCs的分離 觀察組起病24 h內(nèi)、對照組入組時采集外周靜脈血10 mL。加入等體積RPMI1640充分混勻，加入淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法分離PBMCs。分離出的PBMCs在顯微鏡下計數(shù)，然后重懸于10%胎牛血清中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL，用于檢測CD4+T細(xì)胞亞群的百分比。剩余血清置于-80 ℃保存，用于檢測IFN-γ、TNF-α。

1.3 PBMCs中CD4+T細(xì)胞亞群、PD-1+細(xì)胞檢測 用以下帶有熒光標(biāo)記素的小鼠抗人單克隆抗體(CD4-FITC、CD45RA-PE、CCR-7-APC、PD-1-PerCP)來識別CD4+T細(xì)胞三個亞群的表面分子，并使用與以上抗體相對應(yīng)的同型對照來調(diào)整各個通道補(bǔ)償和設(shè)定圈門參數(shù)。避光條件下用以上抗體將分離出的PBMCs染色，4 ℃孵育30 min。流式洗液洗滌3次，重懸于500 μL的1%多聚甲醛/PBS中，4 ℃保存。采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD45RA+CCR7+T細(xì)胞、CD4+CD45RA-CCR7+T細(xì)胞和CD4+CD45RA-CCR7-T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比，PD-1+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞各個亞群的百分比。

1.4 血清IFN-γ、TNF-α檢測 采用ELISA法檢測血清IFN-γ、TNF-α水平，具體步驟參照試劑盒說明書。利用酶標(biāo)儀檢測光密度(OD)值來計算IFN-γ、TNF-α的血清滴度。每個樣本檢測3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血PBMCs中CD4+T細(xì)胞亞群比較 觀察組外周血PBMCs中CD4+CD45RA+CCR7+、CD4+CD45RA-CCR7+、CD4+CD45RA-CCR7-細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比均低于對照組(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 兩組外周血PBMCs中CD4+ T細(xì)胞亞群比較

2.2 兩組外周血PBMCs中PD-1+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞各亞群的百分比比較 觀察組外周血中PD-1+細(xì)胞占CD4+CD45RA+CCR7+、CD4+CD45RA-CCR7+和CD4+CD45RA-CCR7-細(xì)胞的百分比高于對照組(P<0.05或<0.01)。見表2。

表2 兩組外周血PBMCs中PD-1+細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞各亞群的百分比比較

2.3 兩組血清IFN-γ、TNF-α水平比較 觀察組血清IFN-γ、TNF-α水平均低于對照組(P<0.05或<0.01)。見表3。

表3 兩組血清IFN-γ、TNF-α水平比較

2.4 觀察組外周血PBMCs中PD-1+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞各亞型百分比與炎癥因子的相關(guān)性 觀察組外周血中PD-1+細(xì)胞占CD4+CD45RA+CCR7+、CD4+CD45RA-CCR7+和CD4+CD45RA-CCR7-細(xì)胞的百分比與血清IFN-γ、TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。見表4。

表4 腦梗死急性期患者外周血PD-1+細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞各亞群百分比與炎癥因子相關(guān)性分析

3 討論

T細(xì)胞免疫功能異常在腦梗死急性期的免疫抑制和易發(fā)感染的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。臨床研究顯示，腦梗死急性期患者外周血PBMCs中T細(xì)胞免疫功能受到明顯抑制[6，7]。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腦梗死可引起外周免疫抑制，特別是T細(xì)胞免疫功能障礙[8，9]。

外周血PBMCs中的CD4+T淋巴細(xì)胞活化后，誘導(dǎo)T細(xì)胞表面分子PD-1廣泛表達(dá)，PD-1與其配體結(jié)合，發(fā)揮抑制T淋巴細(xì)胞的功能，從而抑制自身免疫應(yīng)答[5]。PD-1與免疫功能存在密切關(guān)系，而炎癥因子IFN-γ、TNF-α水平是反映T細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。為了明確腦梗死急性期免疫抑制的發(fā)生機(jī)制，本研究分析了腦梗死患者PBMCs中CD4+T細(xì)胞三個亞群百分比、PD-1相對表達(dá)水平和炎癥因子水平的差異以及PD-1相對表達(dá)水平和血清炎癥因子水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示，觀察組外周血PBMCs中CD4+T細(xì)胞三個亞群百分比和炎癥因子水平低于對照組，而PD-1在CD4+T細(xì)胞三個亞群的相對表達(dá)水平高于對照組，說明PD-1對CD4+T細(xì)胞的免疫功能具有抑制作用。相關(guān)性分析顯示，觀察組外周血PBMCs中PD-1在CD4+T細(xì)胞三個亞群的相對表達(dá)水平與炎癥因子水平呈負(fù)相關(guān)。

CD4+T細(xì)胞分為三個亞群，即初始T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞。經(jīng)抗原刺激后，初始T細(xì)胞開始抗原提呈特異性T細(xì)胞反應(yīng)，并逐漸分化成熟為記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞。記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞比初始T細(xì)胞有更強(qiáng)的抗原識別能力和釋放炎癥因子(如IFN-γ、TNF-α等)、激活免疫反應(yīng)的能力，從而在清除病原體中發(fā)揮重要作用[10，11]。CD4+T細(xì)胞表面的某些特定分子如PD-1與其免疫功能的發(fā)揮密切相關(guān)，PD-1信號通路與腦梗死后的中樞炎癥反應(yīng)和神經(jīng)功能缺失有重要聯(lián)系[12，13]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PD-1在抑制中風(fēng)模型小鼠T細(xì)胞免疫功能的過程中發(fā)揮作用[14,15]。本研究結(jié)果顯示，腦梗死急性期患者外周血PD-1在CD4+T細(xì)胞三個亞群的相對表達(dá)量明顯升高，而與炎癥因子的血清水平呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，腦梗死急性期患者外周血PBMCs中CD4+T細(xì)胞膜表面分子PD-1的表達(dá)與血清炎癥因子IFN-γ、TNF-α水平有關(guān)。這為明確腦梗死急性期免疫抑制的病理機(jī)制提供了理論參考，也為探索通過抑制PD-1的表達(dá)減少腦梗死后感染并發(fā)癥的策略提供了理論依據(jù)。