雷帕霉素對膿毒癥大鼠心肌自噬水平的影響

黎李俊，楊國輝

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴陽550001)

膿毒癥是指由感染引起的機體器官功能障礙，同時伴有多種細胞因子和炎性介質(zhì)的誘導、合成和釋放的綜合征。超過70%的膿毒癥患者死于多器官功能障礙(MODS)[1]。心臟是膿毒癥主要易損靶器官之一，高達40%的膿毒癥患者伴有心肌功能障礙[2]。近年研究表明，自噬是膿毒癥時細胞程序性死亡的重要調(diào)節(jié)過程[3]，在膿毒癥器官損傷中發(fā)揮重要作用。自噬既是清除受損細胞器對細胞具有保護作用，也是促進細胞凋亡的前體，這取決于有害刺激的強度和持續(xù)時間。我們采用盲腸結扎穿孔法建立膿毒癥急性心肌損傷大鼠模型，用自噬促進劑雷帕霉素干預，觀察心肌自噬水平的改變和膿毒癥心肌損傷的關系。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 健康SPF級雄性SD大鼠54只，8～10周齡，體質(zhì)量250～300 g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，造模前禁食12 h，不禁水。雷帕霉素(Sigma公司，美國)，微管相關蛋白輕鏈3(LC3)抗體(Abcam公司，美國)，自噬接頭蛋白(p62)抗體(Abcam公司，美國)。i-STAT全自動生化分析儀(mindray公司，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與模型建立 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術組、模型組、干預組各18只。腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，腹部正中縱行切開約1.0 cm，暴露盲腸。模型組和干預組在距盲腸末端1/2處用無菌4號絲線結扎盲腸，用20 G套管針將盲腸貫通穿孔2次，注意避開腸系膜和盲腸血管，擠出少許糞便后回納腹腔，逐層縫合腹壁切口；假手術組僅把盲腸拉出腹腔，然后還納腹腔。術后三組均皮下注射預熱的生理鹽水5 mL預防低血容量性休克，干預組給予雷帕霉素6 mg/kg腹腔注射，假手術組和模型組給予等量生理鹽水腹腔注射。待大鼠麻醉蘇醒后送回飼養(yǎng)室正常飼養(yǎng)。

1.2.2 標本采集 術后6、12、24 h，各組分別取6只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉;開腹，腹主動脈采血5 mL，離心分離血清,保存于-80 ℃冰箱，用于檢測心肌肌鈣蛋白(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。取心尖部組織，用于組織形態(tài)學檢查和蛋白檢測。

1.2.3 血清cTnI、CK-MB水平檢測 使用全自動生化分析儀檢測血清cTnI、CK-MB水平。

1.2.4 心肌組織形態(tài)學檢查 取大鼠心尖部，除去大血管和結締組織，取0.5 mm3心肌組織投入10%甲醛中固定，依次行脫水、透明、包埋、切片、蘇木精伊紅染色后光鏡下觀察。

1.2.5 心肌組織自噬相關蛋白LC3、p62檢測 采用Western blotting法。使用組織細胞裂解液勻漿，提取心肌組織總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，通過SDS-PAGE凝膠電泳和濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜。分別加入LC3(1∶2 000)、p62(1∶2 000)一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記相應二抗(1∶5 000)，室溫下孵育50 min，ECL化學發(fā)光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)檢測條帶，Image J軟件測量目的條帶的灰度值，通過與內(nèi)參條帶的灰度值比較來計算目的蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 三組血清cTnI、CK-MB水平比較 與假手術組相比，模型組各時間點血清cTnI、CK-MB水平升高(P均<0.05)；與模型組比較，干預組各時間點血清cTnI、CK-MB水平降低(P均<0.05)。

表1 三組血清cTnI、CK-MB水平比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.2 三組心肌組織形態(tài)學比較 假手術組心肌細胞排列整齊，血管無擴張充血，未見炎癥細胞浸潤；模型組心肌細胞排列紊亂，毛細血管明顯擴張充血，纖維變性壞死，大量炎癥細胞浸潤，以24 h組最為顯著；干預組心肌細胞排列尚齊，可見毛細血管充血，部分炎癥細胞浸潤。

2.3 三組心肌組織LC3、p62蛋白表達量比較 假手術組各時間點心肌組織LC3、p62水平無明顯變化；與假手術組相比，模型組各時間點心肌組織LC3、p62均升高(P均<0.05)；與模型組比較，干預組12、24 h時心肌組織LC3、p62表達升高(P均<0.05)。見表2。

3 討論

在膿毒癥致多器官功能障礙綜合征中，心臟功能障礙是膿毒癥中發(fā)生率比較高的臟器損傷。膿毒癥心肌損傷的機制包括氧化應激與Ca2+超載、線粒體受損、缺血再灌注損傷、炎癥因子對心肌的損害、氧自由基損傷、能量代謝紊亂、細胞凋亡和自噬等[4]。膿毒癥時毒素入血，激活單核以及巨噬細胞和T淋巴細胞釋放炎癥細胞因子和趨化因子，誘導中性粒細胞大量聚集，進而釋放大量促炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等，對機體造成損傷的同時，形成惡性循環(huán)，進而產(chǎn)生全身過度炎癥級聯(lián)瀑布反應體系，最終導致心肌損傷[5]。cTnI、CK-MB是心肌損傷的敏感標志物，臨床上常用來評估心肌損傷的程度，也是膿毒癥患者判斷預后的特異性和敏感標志物。本研究結果顯示，模型組造模6、12、24 h時血清cTnI、CK-MB水平均高于假手術組，且隨時間延長升高更加明顯；而干預組各時間點血清cTnI、CK-MB水平均較模型組下降。這表明膿毒癥大鼠存在心肌細胞損害，給予雷帕霉素干預后心臟的炎癥反應降低，心肌損傷明顯減輕。

表2 各組心肌組織LC3、p62蛋白表達量比較

注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

自噬是細胞利用溶酶體降解細胞質(zhì)以及受損細胞器的過程，是一種重要的防御保護機制。正常水平的自噬有助于機體及時清除衰老的細胞器和變性蛋白質(zhì)，以維持細胞結構、功能和代謝的需求，維持細胞正常的生理功能[6]。在遇到感染應激情況下自噬會增強，降解受損細胞器和清除病原體，以減輕機體的炎癥反應[7]。研究認為，在生理反應或輕度壓力下，自噬可以促進細胞存活，是適應性的；但在嚴重應激情況下，自噬不足導致大量有害物質(zhì)堆積，最終造成細胞死亡[8]。自噬主要包括以下過程：杯狀雙層分離膜的形成，杯狀雙層分離膜延伸包裹受損細胞器，杯狀雙層分離膜閉合形成自噬體，自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，自噬溶酶體降解[9]。自噬相關蛋白LC3和p62是自噬體膜的標志蛋白，貫穿自噬體形成的始終，其表達增加提示自噬體形成。本研究結果顯示，模型組和干預組心肌組織均可見LC3、p62表達，干預組12、24 h時心肌組織LC3和p62蛋白表達水平較模型組升高，且24 h高于12 h；而模型組和干預組6 h時心肌組織LC3和p62蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異。這提示膿毒癥時心肌因炎癥刺激、微生物入侵導致心肌細胞受損，并激活了自噬。雷帕霉素是自噬促進劑，通過抑制mTOR信號通路促進自噬的發(fā)生。研究表明，激活自噬可抑制細胞炎性凋亡，減少炎癥因子產(chǎn)生[10]。本研究結果顯示，模型組造模6 h即有自噬發(fā)生，而經(jīng)過雷帕霉素干預后，自噬相關蛋白LC3和p62明顯升高，且心肌組織中炎性細胞浸潤減少，血清cTnI、CK-MB水平降低，說明炎癥反應被抑制，進一步說明雷帕霉素可促進心肌自噬的發(fā)生，有利于改善膿毒癥所致心肌損傷。

綜上所述，膿毒癥早期即可見心肌組織中自噬的發(fā)生，雷帕霉素通過促進自噬的形成，有利于清除受損細胞器和減輕膿毒癥心肌組織的炎癥反應，從而減輕膿毒癥所致的心肌損傷。