太白楤木總皂苷對(duì)肝纖維化小鼠氧化應(yīng)激水平的影響及機(jī)制

黃攀，潘曉霞，李濤，范妤

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712046)

肝纖維化是慢性肝損傷的特征，其發(fā)生是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子以及信號(hào)傳導(dǎo)通路之間相互作用的結(jié)果，氧化應(yīng)激在肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[1]。楤木產(chǎn)自秦嶺及大巴山區(qū)，其根皮可入藥，具有祛風(fēng)除濕、活血散瘀、消腫止痛、健脾利水的功效，臨床常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急慢性肝炎、跌打損傷、骨折和糖尿病。太白楤木為楤木屬的一種，其根皮中含有豐富的太白楤木總皂苷(TSAT)。研究顯示，TSAT具有良好的保肝活性和抗纖維化作用[2，3]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。Keap1-Nrf2-ARE通路是體內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激通路之一，核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是該通路中的關(guān)鍵酶，而血紅素加氧酶-1(HO-1)是其下游抗氧化酶之一。2018年7～12月，我們采用CCl4制作肝纖維化小鼠模型，觀察TSAT對(duì)小鼠氧化應(yīng)激水平的影響，并探討其與Keapl-Nrf2-ARE信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與藥品 清潔級(jí)健康雄性昆明小鼠40只，體質(zhì)量(20±3)g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠分籠飼養(yǎng)，室溫保持(25±3)℃，自由進(jìn)水，普通飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。TSAT溶液由陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑設(shè)計(jì)研究室提供，用蒸餾水配制成200、400 mg/kg的TSAT混懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器 羥脯氨酸(HYP)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Masson三色染色液試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；DAB顯色試劑盒、兔抗Nrf2、購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗HO-1、SABC免疫組化試劑盒、BCA蛋白定量測(cè)試盒均購(gòu)自武漢博士德，DM4000B生物顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)，Bio-Tek ELX808IU酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組造模與藥物干預(yù) 將40只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、TSAT高劑量組和TSAT低劑量組，每組各10只。模型組及TSAT高、低劑量組給予腹腔注射0.15 mL/kg(按10%溶于橄欖油中)的CCl4溶液，對(duì)照組腹腔注射等量橄欖油，2次/周，連續(xù)8周。造模同時(shí)，TSAT高、低劑量組分別給予400、200 mg/kg TSAT混懸液灌胃，其他兩組灌注等量生理鹽水，1次/d，持續(xù)8周。8周后將小鼠注射10%水合氯醛麻醉，取肝臟組織，將肝大葉用4%多聚甲醛固定用于病理切片，剩余肝臟組織置于-80 ℃保存，用于制備肝組織勻漿和提取肝組織蛋白。

1.2.2 肝組織形態(tài)學(xué)及膠原纖維沉積情況觀察 取肝大葉組織，石蠟包埋，切成4 μm厚切片。行HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化；行肝組織Masson染色，嚴(yán)格按照試劑盒步驟操作，顯微鏡下觀察膠原纖維的沉積情況。

1.2.3 肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取肝右葉剪碎，加入裂解液再勻漿，離心取上清液。使用堿水解法檢測(cè)HYP含量，TBA法檢測(cè)MDA含量，WST-1法檢測(cè)SOD活性。嚴(yán)格按照說明書步驟操作。

1.2.4 Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)因子Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SABC法。肝組織切片常規(guī)脫蠟、水化，放入枸櫞酸鹽緩沖液中加熱，用油筆畫圈后滴加5% BSA封閉液，一抗、二抗孵育，滴加試劑SABC，再DAB顯色、復(fù)染，最后脫水、透明，中性樹膠封片，光鏡(×200)下觀察。每張切片隨機(jī)取5個(gè)不重疊視野拍照，Image-Pro軟件處理圖像，分析光密度(OD)值。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織形態(tài)學(xué)比較 HE染色顯示，對(duì)照組肝臟組織形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞排列整齊，未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，排列不規(guī)則，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和大量脂肪空泡，形成假小葉，出現(xiàn)大量肝細(xì)胞變性或壞死，而且形成膠原纖維增生；TSAT高、低劑量組與模型組比較，肝組織結(jié)構(gòu)破壞程度緩解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，TSAT高劑量組較低劑量組改善更加明顯。

2.2 各組肝組織膠原纖維沉積情況比較 Masson染色顯示，對(duì)照組肝板排列整齊，無膠原纖維增生；模型組形成大量藍(lán)色膠原沉積，在肝小葉中央和匯管區(qū)出現(xiàn)膠原纖維束；TSAT高、低劑量組與模型組比較，肝組織結(jié)構(gòu)損傷得到不同程度的緩解，藍(lán)色膠原沉積明顯減少，TSAT高劑量組較低劑量組膠原纖維沉積顯著減少。

2.3 各組肝組織HYP、MDA含量及SOD活性比較 與對(duì)照組比較，模型組HYP、MDA含量升高，SOD活性降低(P均<0.01)；與模型組比較，TSAT高、低劑量組HYP、MDA水平均下降，SOD活性均升高(P均<0.01)，且TSAT高劑量組HYP、MDA水平低于低劑量組，SOD活性高于低劑量組(P均<0.05)。見表1。

2.4 各組肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)下降(P均<0.01)；與模型組比較，TSAT高、低劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)均上升(P均<0.01)，TSAT高劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)高于低劑量組(P均<0.05)。見表2。

表1 各組肝組織HYP、MDA含量及SOD活性比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；與TSAT低劑量組比較，&P<0.05，&&P<0.01。

表2 各組肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；與TSAT低劑量組比較，&P<0.05。

3 討論

肝纖維化是由慢性肝損傷導(dǎo)致的病理改變，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積和瘢痕形成，進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，甚至引起肝癌。研究顯示，當(dāng)肝損傷的因素被去除后，纖維化過程是可逆的;但是，針對(duì)病毒感染等病因的治療效果并不理想，而且目前尚無特異性治療肝纖維化的藥物。因此，肝纖維化的發(fā)生機(jī)制及關(guān)鍵靶點(diǎn)仍需深入研究。許多中藥及其提取物的有效成分具有良好的抗纖維化作用，而且中藥具有不良反應(yīng)小、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)。太白楤木根皮是治療肝炎的民間藥物，TSAT是其有效成分。胡文軍等[4]報(bào)道，TSAT可降低血清GPT、GOP活力，從而減輕由CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。崔大江等[5]發(fā)現(xiàn)，TSAT能降低肝纖維化大鼠血清TGF-β1水平，并抑制Smads4基因表達(dá)，從而減弱TGF-β1-Smad信號(hào)通路介導(dǎo)的肝損傷和膠原產(chǎn)生。

ECM的重要功能是維持組織穩(wěn)態(tài)和形成纖維支架。在慢性肝損傷時(shí)，ECM增生與降解失衡，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟內(nèi)膠原纖維異常沉積并形成瘢痕組織，從而引起肝纖維化。所以,減少ECM過度沉積是治療肝纖維化的主要策略。黃苗等[6]報(bào)道，太白楤木可降低肝纖維化大鼠肝臟中Ⅰ型膠原纖維、Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)，從而抑制膠原纖維增生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，大量肝細(xì)胞變性或壞死和藍(lán)色膠原沉積，表明小鼠肝纖維化模型制作成功，肝臟內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎癥、肝細(xì)胞損傷和膠原纖維增生。與模型組比較，TSAT高、低劑量組肝細(xì)胞破壞程度明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和藍(lán)色膠原沉積減少，高劑量組較低劑量組改善更加明顯。表明肝纖維化小鼠經(jīng)TSAT治療后，肝細(xì)胞形態(tài)得到修復(fù)，肝纖維化癥狀明顯減輕，并且能夠有效抑制肝組織中膠原的分泌和沉積，從而減輕肝損傷和膠原纖維增生，表明TSAT具有抗纖維化作用。

研究顯示，氧化應(yīng)激參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[7]。在氧化應(yīng)激過程中，過度積累的活性氧(ROS)會(huì)破壞大分子，增加脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死和凋亡，并且直接激活HSC和刺激促纖維因子的產(chǎn)生。因此，靶向氧化應(yīng)激損傷將有助于肝纖維化的治療。HYP能夠反映肝組織中總膠原蛋白的水平，可作為纖維化的標(biāo)志物[8]。MDA是脂質(zhì)過氧化醛類最終產(chǎn)物之一，其升高程度可反映肝組織中脂質(zhì)過氧化損傷的程度[9]。SOD是一種重要的抗氧化酶，其作用是清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，其活性可反映肝臟清除氧自由基和抗氧化的能力[10]。Xi等[11]報(bào)道，TSAT在體外可以有效清除自由基，并且能夠抑制大鼠肝微粒體的脂質(zhì)過氧化，證明TSAT具有抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組HYP、MDA水平升高而SOD活性下降，說明小鼠肝組織纖維化程度加重，脂質(zhì)過氧化水平增加。經(jīng)TSAT治療后，肝纖維化小鼠肝臟內(nèi)HYP、MDA水平下降而SOD活性增強(qiáng)，證實(shí)TSAT具有顯著的抗氧化活性，并降低肝臟內(nèi)膠原纖維增生和氧化應(yīng)激水平。

Keap1-Nrf2-ARE通路是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路之一，其中Nrf2是抗氧化損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。氧化應(yīng)激時(shí)Nrf2與Keap1解離，然后激活A(yù)RE并抑制其下游抗氧化酶(如GSH、HO-1)的表達(dá)。Nrf2可以調(diào)節(jié)各種抗氧化劑和解毒酶表達(dá)，其在抗氧化損傷中起重要作用，因此通過激活Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)通路將有助于減輕肝纖維化。李成全等[12]發(fā)現(xiàn)，在用H2O2誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞OS模型中，太白楤木竹節(jié)參皂苷Ⅳa(CHS)以劑量依賴性方式降低細(xì)胞總ROS和線粒體ROS水平，并抑制抗氧化應(yīng)激Nrf2通路Nrf2、HO-1、GCLC和GCLM相關(guān)蛋白表達(dá)，說明CHS具有顯著的抗氧化作用。郭育等[13]報(bào)道，TSAT可顯著抑制tBHP導(dǎo)致的細(xì)胞ROS水平升高，并引起Nrf2及其下游的HO-1、GCLC、GCLM表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低，說明由CCl4引起的肝損傷抑制了Keap1-Nrf2-ARE抗氧化途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，使肝臟抗氧化損傷能力降低，肝纖維化小鼠經(jīng)TSAT治療后，Keap1-Nrf2-ARE通路相關(guān)因子Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高，表明TSAT通過激活Keap1-Nrf2-ARE途徑，增加其下游靶蛋白HO-1的表達(dá)，從而減輕由ROS引起的肝損傷和肝纖維化。

綜上所述，TSAT能夠通過抑制氧化應(yīng)激水平而減少小鼠肝組織中膠原的合成分泌，從而抑制肝纖維化,其抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制可能與上調(diào)肝組織Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路中Nrf2表達(dá)和激活其下游抗氧化酶HO-1相關(guān)。