膽固醇結石病小鼠膽囊組織中Rho-ROCK信號、鈣調信號相關分子的表達及意義

李剛，劉江豪，牛青青

(新疆維吾爾自治區生殖健康醫院，烏魯木齊830000)

膽固醇結石病(膽石病)是常見的消化系統疾病，隨著生活水平的提高、人口老齡化和健康檢查的普及，其發病率和檢出率逐年上升[1，2]。膽石病的發病機制尚未完全闡明，目前認為膽石病是肝臟脂質代謝異常的結果，如脂質和膽汁鹽不平衡、膽固醇過飽和等；此外，膽囊功能異常與膽石病的發生發展也有密切關系，如膽囊排空異常、濃縮增強、脂質吸收紊亂等[3～5]。Rho GTP酶屬于Ras超家族，RhoA和RhoB是Rho GTP酶的重要成員；ROCK又稱Rho激酶，是Rho的下游信號分子。研究表明，在膽囊平滑肌細胞中，Rho-ROCK信號通路能夠通過調節鈣調信號通路影響膽囊平滑肌的收縮功能[6]。Ca2+依賴性肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)與Ca2+非依賴性肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)雙重調節肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化水平，前者對MLC磷酸化的調節導致平滑肌收縮，而后者抑制平滑肌收縮并增加Ca2+敏感性。膽囊平滑肌收縮異常能夠引起膽囊功能異常，與膽石病的發生密切相關。目前關于Rho-ROCK信號和鈣調信號通路與膽石病關系的研究較少。2018年3月～2019年5月，我們采用高膽固醇飲食誘導制作膽石病小鼠模型，觀察小鼠膽囊組織中Rho-ROCK信號相關分子RhoA、RhoB、ROCK和鈣調信號相關分子MLCK、p-MLC、MLCP的表達，探討Rho-ROCK信號和鈣調信號相關分子在膽固醇結石形成過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性C57BL/6小鼠40只，體質量20～22 g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，正常飲食適應性喂養1周后用于實驗。MLCK、p-MLC、MLCP、RhoA、RhoB、ROCK、GAPDH抗體(Abcam，英國)；蛋白裂解液(碧云天，中國)；羊抗兔IgG-HRP抗體、羊抗鼠IgG-HRP抗體(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天，中國)；牛血清白蛋白(BSA，北京索萊寶科技有限公司，中國)；戊巴比妥鈉(Sigma，美國)；Fluo-3 AM(碧云天，中國)；96孔板(康寧，美國)；熒光酶標儀(賽默飛，美國)；HITACHI自動分析儀7600(Tokyo，日本)；TRIzol裂解液及RT-PCR逆轉錄和定量試劑盒(諾唯贊，中國)；NanoDrop 2000 Spectrophotometer(賽默飛，美國)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天，中國)；PVDF膜(Millipore，美國)。本實驗通過動物倫理委員會審核批準。

1.2 動物分組與模型制作 將小鼠隨機分為對照組和膽石組各20只，對照組給予正常飲食，膽石組給予高脂飲食(1.0%膽固醇、0.5%脂肪酸和20%脂肪)，飲水不限，喂養8周。以小鼠膽囊出現膽泥或結石為造模成功。

1.3 膽囊結石形成情況觀察 腹腔注射戊巴比妥鈉35 mg/kg麻醉小鼠，腹部切口，暴露膽囊、膽總管，觀察膽囊有無結石形成以及結石形態。

1.4 膽汁分泌率測算 膽總管插管，另一端接1.5 mL EP管，利用重力作用收集1 h膽汁，計算膽汁分泌率，膽汁分泌率=膽汁體積/(膽汁質量×時間)。

1.5 膽汁鈣離子檢測 用去離子水稀釋膽汁，加入96孔板，然后加入Fluo-3 AM(Ca2+熒光探針)，37 ℃孵育60 min，將96孔板置于熒光酶標儀(激發波長488 nm，發射波長530 nm)檢測熒光值。

1.6 血清和膽汁膽固醇檢測 眼球取血1.5 mL，3 000 r/min離心5 min，取上清。取“1.4”收集的膽汁，加入去離子水稀釋膽汁和血清，使用HITACHI自動分析儀檢測總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。非HDL-C=總膽固醇-HDL-C。

1.7 膽囊病理組織學檢查 小鼠脫頸椎處死，取出膽囊，切取約30 mg，置于4%多聚甲醛固定，剩余膽囊組織放入液氮保存。梯度乙醇脫水，蠟塊包埋，切5 μm厚切片。將玻片脫蠟，行HE染色，顯微鏡下觀察膽囊組織病理變化。

1.8 膽囊組織Rho-ROCK信號和鈣調信號相關分子mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取凍存的膽囊組織，稱取約50 mg，加入1 mL TRIzol裂解液提取組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。使用配有SYBRs Green Master Mix的CFX ConnectTMReal-Time系統進行qRT-PCR定量分析。RT-PCR引物序列：MLCK上游5′-CAACAGTGGCAATGGAGC-3′，下游5′-GATTCGCAATGAAACAATCA-3′；p-MLC上游5′-ACCTGCGTAACTCCAATCT-3′，下游5′-TTGTCCGACCAGTTCTTC-3′；RhoA上游5′-CCAAATGTGCCCATCATCCTAGTTG-3′，下游5′-TCCGTCTTTGGTCTTTGCTGAACAC-3′；ROCK上游5′-AGGCCTGTGCCAAACCTTT-3′，下游5′-TGGTCCCTGTGGGACTTAACA-3′；RhoB上游5′-ATATTAGCGTGGGCACCGAG-3′，下游5′-GTAGGGGTGTAGGGAGTCGT-3′；GAPDH上游5′-TTCTACAATGAGCTGCGTCT-3′，下游5′-CTCATAGCTCTTCTCVAGGG-3′。擴增體系：2×SYBRs Green Master Mix，10 μL；引物(10μmol/L)，0.8 μL；50×ROX Reference Dye 1，0.4 μL；cDNA，8.8 μL。擴增條件：預變性94 ℃，5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.9 膽囊組織Rho-ROCK信號和鈣調信號相關分子蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取膽囊組織約50 mg，加入1 mL蛋白裂解液提取組織總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取20～50 μg總蛋白，經10%的SDS-PAGE膠電泳，電轉移至PVDF膜，用5%的BSA封閉60 min。TBST洗滌，加入一抗(MLCK、p-MLC、MLCP、RhoA、RhoB、ROCK、GAPDH，以1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌加入HRP標記山羊抗兔二抗(以1∶10 000稀釋)，室溫孵育，TBST洗滌。用ECL化學發光法顯影，Image J軟件分析灰度值。以目的蛋白與GAPDH的比值計算目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組膽囊結石發生情況、膽汁分泌率及Ca2+水平比較 對照組膽囊無結石和膽泥形成，膽石組膽囊出現膽結石6只、膽泥5只，其余9只未造模成功被排除。膽石組膽汁分泌率及Ca2+水平均低于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組膽汁分泌率及Ca2+水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組血清和膽汁膽固醇水平比較 與對照組相比，膽石組血清和膽汁總膽固醇、非HDL-C水平均升高(P均<0.05)，兩組HDL-C水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組血清和膽汁膽固醇水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組膽囊組織病理學結果比較 對照組膽囊壁無增生，基質層中炎癥細胞浸潤較少；膽石組膽囊壁增厚，基質層中性粒細胞浸潤，具有明顯炎癥跡象。

2.4 兩組膽囊組織鈣調信號相關分子mRNA及蛋白表達比較 與對照組比較，膽石組膽囊組織MLCK、p-MLC mRNA及蛋白表達下調，MLCP mRNA及蛋白表達上調(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組膽囊組織鈣調信號相關分子mRNA及蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.5 兩組膽囊組織中Rho-ROCK信號相關分子mRNA及蛋白表達比較 與對照組相比，膽石組膽囊組織RhoA、RhoB、ROCK mRNA及蛋白表達均下調(P均<0.05)。見表4。

表4 兩組膽囊組織Rho-ROCK信號相關分子mRNA及蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

研究顯示，膽石病的發生與脂代謝異常、膽囊功能異常、膽固醇過飽和等多種因素相關，但其具體機制目前仍未闡明。Rho-ROCK信號和鈣調信號在糖尿病腎病、神經性疾病、腫瘤及心臟病等重大疾病的發生過程中發揮重要作用，作為疾病治療靶點廣受關注[6]，但是其在膽石病發生中的研究較少。本研究通過高脂飲食誘導制作小鼠膽石病模型，表現為膽結石的發生率、膽汁和血清中的總膽固醇和非HDL-C含量顯著上調，上述這種變化很好地模擬了膽石病患者的相關脂質變化。

膽固醇結石的形成并不完全依賴于膽囊生理和化學環境的改變，膽囊功能特別是其收縮功能障礙在膽結石的形成過程中起關鍵作用[7，8]。膽囊中晶體的形成能夠顯著抑制膽囊排空，影響膽汁分泌[9，10]。Ca2+在膽囊平滑肌收縮過程中起重要作用，其能夠通過調節膽囊收縮影響膽囊排空和膽汁分泌[11]。本研究顯示，膽石組膽汁分泌率下降，膽汁中Ca2+含量下降，表明Ca2+含量降低可能通過鈣調信號通路影響膽囊平滑肌收縮，引起膽囊功能異常，最終導致膽石病的發生。

MLC磷酸化水平受到MLCK和MLCP的雙重調節，其在平滑肌收縮過程中起關鍵作用[12]。Ca2+含量升高時，MLCK使MLC磷酸化導致平滑肌收縮，而MLCP使MLC去磷酸化，抑制平滑肌收縮[13]。本研究結果顯示，長期給予高脂飲食能夠顯著下調膽汁中的Ca2+濃度，膽囊組織中MLCK和p-MLC蛋白及mRNA表達下調，MLCP蛋白和mRNA表達上調。在平滑肌細胞中MLCP上調能夠抑制Ca2+的敏感性，并促進MLC的磷酸化水平，導致平滑肌收縮抑制[14]。以上研究表明，MLC在膽囊的收縮過程中起著關鍵作用。

研究顯示，Rho-ROCK信號通路能夠通過調節MLC的磷酸化和去磷酸化水平來調節平滑肌的收縮過程[15]。當ROCK表達抑制或下調時，MLC表達將會下調且MLCP的活性增強，ROCK可能通過抑制MLCP的活性來調節平滑肌的收縮[16]。本研究結果顯示，長期給予高脂飲食能夠顯著下調膽囊中的RhoA、RhoB、ROCK的蛋白和mRNA表達，表明Rho-ROCK信號通路在膽石病的發生發展過程中具有重要作用。

綜上所述，高脂飲食可致膽汁中Ca2+水平下降、膽汁和血清中總膽固醇和非HDL-C含量升高，誘導膽固醇結石形成。高脂飲食誘導結石形成過程中膽囊組織出現炎癥跡象及Rho-ROCK和鈣調信號相關分子表達出現變化，提示Rho-ROCK和鈣調信號相關分子可能參與高脂飲食誘導膽固醇結石的形成過程。本研究為膽石病相關治療藥物的開發提供了一定的線索。