右美托咪定對蛛網膜下腔出血大鼠早期腦損傷的影響及機制

崔雪皎，蘇林，馮磊，李鳳麗，霍小君，于寶臣

(1天津市寧河區醫院，天津301500；2天津醫科大學總醫院；3天津市第三中心醫院)

蛛網膜下腔出血(SAH)是臨床上常見的一種腦血管危重癥疾病，病死率和致殘率高達50%[1]。早期腦損傷是指SAH后72 h內由多因素造成的腦組織的整體性損傷。目前研究認為，早期腦損傷可通過腦水腫、血腦屏障紊亂、炎癥、氧化應激和凋亡等多種途徑影響預后[2]。右美托咪定(Dex)是一種高度選擇性的腎上腺素2受體激動劑，在鎮靜和鎮痛方面有極好的效果，臨床上常用作輔助麻醉。研究表明，Dex在成年動物創傷性腦損傷和腦缺血后具有神經保護作用，參與抗炎、氧化應激、血腦屏障修復及抗凋亡等多種病理生理的調控過程[3]。Wang等[4]報道，Dex可通過激活細胞外信號調節激酶，為SAH后的大鼠提供神經保護作用。2018年3～12月，我們通過制作SAH大鼠模型，觀察Dex對SAH大鼠神經功能的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性SD大鼠50只，體質量250～300 g，購自中國醫學科學院放射醫學研究所。Dex購自美國Sigma-Aldrich公司，Iba1抗體、CD86抗體、CD206抗體、山羊抗鼠的IgG、Occludin抗體、ZO-1抗體均購自美國Abcam公司，caspase-3(激活型)抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠IgG、極超敏ECL化學發光試劑盒、DAPI、熒光防淬滅劑、大鼠IL-4、IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒以及BCA試劑盒購自上海碧云天公司，IL-13 ELISA試劑盒購自上海Bio-Techne公司。

1.2 動物分組、造模及干預 將大鼠隨機分為假手術組10只、SAH組20只、SAH+Dex組20只，采用頸內動脈刺破法建立SAH模型[5]。向大鼠腹腔內注射水合氯醛麻醉，仰臥位固定。于頸部正中線偏右側做長約2 cm的斜切口，暴露并分離頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈。用動脈鉗夾住頸總動脈和頸內動脈，用尼龍縫線將頸外動脈結扎并在結扎處近端切開。移開頸內動脈上的動脈鉗，將腦中動脈閉塞單纖維絲通過頸外動脈推入頸內動脈，當感到一定阻力時，將單纖維絲再向前推進1～2 mm，使血管穿孔。移除單纖維絲，完成結扎，移開頸總動脈的動脈鉗，縫合傷口。SAH組和SAH+Dex組建立SAH模型，假手術組僅進行手術操作但不穿孔。術后2 h，SAH+Dex組腹腔注射1 mg/mL Dex溶液500 μL，SAH組腹腔注射等體積生理鹽水，假手術組不干預。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經功能評分 術后24 h，采用Garcia 18分評價法進行神經功能評分。包括自主運動、提住鼠尾懸空時四肢活動對稱性狀況、提住鼠尾放置桌面邊緣觀察前爪伸展、攀爬和抓持鐵籠能力、身體感覺反應、對觸碰胡須的反應6個項目，總分最高18分、最低3分。

1.3.2 腦水分含量 采用干-濕法檢測術后24 h腦水分含量。神經功能評分結束后，每組各取4只大鼠，麻醉后取腦組織，移除小腦和腦干，剩余部分稱重，記為濕重。將其置于100 ℃爐內干燥24 h，重新稱重，記為干重。腦水分含量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3 SAH分級評分 取剩余大鼠麻醉后處死，暴露腦組織基底池。將基底池分為6個部分，按以下方法對各部分進行評分：蛛網膜下腔沒有血液為0分，蛛網膜下腔有少量血液為1分，中度凝血并有可識別的動脈為2分，血塊覆蓋所有動脈為3分。將6部分得分總和作為SAH分級評分。

1.3.4 腦組織小神經膠質細胞及其亞型含量 采用免疫熒光雙標法。取大鼠腦組織，加入4%多聚甲醛固定，經脫鈣液脫鈣后，連續切6 m厚切片，加入胎牛血清封閉30 min。加入一抗(Iba1抗體1∶500，CD86抗體1∶200，CD206抗體1∶200)，37 ℃孵育過夜，PBS沖洗。加入熒光二抗(1∶100)，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗2次。加入DAPI染料，常溫染色5 min后，PBS洗3次。滴加熒光防淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。Iba1用于標記小神經膠質細胞，陽性細胞呈綠色熒光；CD86和CD206分別用于標記小神經膠質細胞M1、M2型，陽性細胞呈紅色熒光。采用Image Pro Plus軟件計數Iba1/CD86雙陽性細胞數、Iba1/CD206雙陽性細胞數、Iba1陽性細胞數。M1型含量(%)=Iba1/CD86雙陽性細胞數/Iba1陽性細胞數100%,M2型含量(%)=Iba1/CD206雙陽性細胞數/Iba1陽性細胞數100%。每只大鼠隨機取10個視野(400)，求平均值。

1.3.5 腦組織IL-4、IL-13、IL-1、IL-6、TNF-α含量 采用ELISA法。取大鼠腦組織，置于含蛋白酶抑制劑的組織蛋白裂解液中，在冰塊上手動勻漿，10 000 g/min離心5 min。取上清液1 mL，采用ELISA試劑盒檢測IL-4、IL-13、IL-1、IL-6、TNF-α含量。

1.3.6 血腦屏障相關蛋白Occludin、ZO-1及凋亡相關蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2表達 采用Western blotting法。取大鼠腦組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒定量總蛋白。取20 g總蛋白加入上樣緩沖液中，用10%的SDS-PAGE凝膠分離總蛋白，轉膜后用3%的胎牛血清室溫封閉45 min，加入一抗(Occludin 1∶50 000、ZO-1 1∶800、caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。加入二抗(1∶10 000)，室溫搖床孵育45 min，ECL暗室發光。采用美國Bio-Rad公司的凝膠成像系統及Quantity One4.6.2軟件統計分析條帶。以目的條帶與內參GAPDH光密度的比值作為蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 三組神經功能評分、腦水分含量、SAH分級評分比較 假手術組無大鼠死亡，SAH組死亡8只，SAH+Dex組死亡5只。與假手術組比較，SAH組神經功能評分降低，腦水分含量和SAH分級評分增加(P均<0.05)。與SAH組比較，SAH+Dex組神經功能評分增加、腦水分含量降低(P均<0.05)，SAH分級評分無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經功能評分、腦水分含量及SAH分級評分比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAH組比較，#P<0.05。

2.2 三組腦組織小神經膠質細胞及其亞型含量比較 SAH組小神經膠質細胞形態較圓，SAH+Dex組小神經膠質細胞形態呈長型、紡錘樣形態。與假手術組比較，SAH組小神經膠質細胞數及M1型含量均增加(P均<0.05)，M2型含量無顯著變化(P>0.05)。與SAH組相比，SAH+Dex組小神經膠質細胞數和M1型含量降低，M2型含量增加(P均<0.05)。見表2。

表2 三組腦組織小神經膠質細胞及其亞型含量比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAH組比較，#P<0.05。

2.3 三組腦組織炎癥因子水平比較 與假手術組比較，SAH組IL-13含量降低，IL-1、IL-6、TNF-α含量升高(P均<0.05)，IL-4含量無顯著變化(P>0.05)；與SAH組比較，SAH+Dex組IL-4、IL-13含量升高，IL-1、IL-6、TNF-α含量降低(P均<0.05)。見表3。

表3 三組腦組織炎癥因子含量比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAH組比較，#P<0.05。

2.4 三組腦組織血腦屏障相關蛋白表達比較 與假手術組比較，SAH組Occludin、ZO-1蛋白表達降低；與SAH組比較，SAH+Dex組Occludin、ZO-1蛋白表達增加(P均<0.05)。見表4。

表4 三組Occludin、ZO-1蛋白表達比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAH組比較，#P<0.05。

2.5 三組腦組織中細胞凋亡相關蛋白表達比較 與假手術組比較，SAH組caspase-3、Bax蛋白表達及Bax/Bcl-2升高，Bcl-2蛋白表達降低；與SAH組比較，SAH+Dex組caspase-3、Bax蛋白表達及Bax/Bcl-2降低，Bcl-2蛋白表達升高(P均<0.05)。見表5。

3 討論

研究顯示，早期腦損傷可能是SAH后24～72 h內高病死率的重要原因，此外早期腦損傷也參與遲發性缺血損傷和持續性神經損傷的發病[1]。早期腦損傷的病理生理學過程非常復雜，涉及多種分子機制，包括炎癥、血腦屏障破壞和神經細胞凋亡等[6]。這些機制促進了早期腦損傷的病情進展，是臨床治療的潛在靶標。Dex作為一種麻醉劑，具有較好的鎮痛、鎮靜、抗焦慮作用。研究顯示，Dex用于急性腦損傷患者的手術麻醉，可有效降低腦組織損傷及炎癥反應[7]。動物實驗表明，Dex可降低大鼠體溫并減輕繼發性腦損傷，對創傷性腦損傷和腦缺血也具有神經保護作用[8]。但是Dex對SAH后早期腦損傷的影響以及機制尚未完全闡明。

表5 三組腦組織細胞凋亡相關蛋白表達比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與SAH組比較，#P<0.05。

本研究采用神經功能評分、腦水分含量及SAH分級評分評估Dex對SAH大鼠神經功能、腦水腫及SAH嚴重程度的影響。結果表明，造模24 h內，假手術組無大鼠死亡，SAH組死亡8只，SAH+Dex組死亡5只，表明SAH導致大鼠病死率增加。與假手術組比較，SAH組神經功能評分顯著降低，腦水分含量和SAH分級評分顯著增加，表明SAH后24 h內大鼠的神經功能受損，發生腦水腫，且蛛網膜下腔出血嚴重，提示造模成功。與SAH組比較，SAH+Dex組神經功能評分顯著增加，腦水分含量顯著降低，SAH分級評分無顯著變化，表明Dex可降低SAH導致的神經神經損傷，緩解腦水腫，雖然對SAH的程度并沒有顯著的改善作用，但是已經遏制住了SAH的進展。

炎癥反應在SAH后早期腦損傷的發病機制中起著至關重要的作用，包括炎癥細胞的活化和促炎因子的釋放。SAH后，許多免疫細胞通過受損的血腦屏障進入大腦，尤其是巨噬細胞和中性粒細胞。在數小時內，這些細胞到達損傷區域，持續激活固有細胞，釋放大量炎癥因子，導致中樞神經系統中毒，造成繼發性腦損傷[9]。小神經膠質細胞是大腦中的固有免疫細胞，在SAH及神經退行性疾病等病理條件下，小神經膠質細胞會發生形態、基因表達及功能上的一系列變化，成為激活狀態。激活后的小神經膠質細胞有M1和M2兩種亞型。M2型小神經膠質細胞可釋放抗炎因子(如IL-4、IL-13)、神經營養因子、吞噬損傷的神經細胞、促進組織修復及神經元再生等，發揮神經保護作用。但是當其被過度刺激激活時，則會轉為M1型，釋放大量炎癥因子(如IL-1、IL-6、TNF-α、ROS等)，對神經細胞產生毒性作用[10]。本研究結果顯示，與假手術組比較，SAH組Iba1陽性細胞數和M1型含量均顯著增加，M2型含量無顯著變化；SAH組抗炎因子IL-13水平降低，而促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α水平升高。提示SAH可激活小神經膠質細胞且維持M1型，進而釋放大量促炎因子，對腦組織產生毒性作用。而與SAH組相比，SAH+Dex組Iba1陽性細胞數和M1型含量均顯著降低，M2型含量顯著增加；抗炎因子IL-4、IL-13水平升高，促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α水平降低。提示Dex可誘導SAH狀態下的M1型向M2型轉化，進而降低M1型釋放的促炎因子，增加M2型釋放的抗炎因子，緩解炎癥。因此推測，Dex對SAH后早期腦損傷的保護作用可能與其誘導小神經膠質細胞M1型向M2型轉化、進而降低促炎因子的釋放、增加抗炎因子的釋放有關。

血腦屏障受損可引起腦水腫、腦腫脹和神經元死亡，是導致SAH后早期腦損傷的重要原因。血腦屏障破壞后，血液中的免疫細胞可通過受損的血腦屏障遷移到受傷區域，這可能會加重腦損傷。緊密連接蛋白包括Occludin、ZO-1和claudin-5，是血腦屏障重要的組成部分，能夠連接內皮細胞、周細胞、神經元、星形膠質細胞和細胞外基質[11]。緊密連接蛋白表達異常是血腦屏障損傷的重要標志。本研究結果顯示，與假手術組比較，SAH組Occludin及ZO-1蛋白表達顯著降低，表明SAH后24 h大鼠血腦屏障受到破壞；與SAH組比較，SAH+Dex組Occludin及ZO-1蛋白表達顯著增加，表明Dex可緩解SAH后24 h的血腦屏障損傷，增加血腦屏障的完整性，從而阻止免疫細胞進入腦組織誘發炎癥。這可能是Dex緩解SAH后神經損傷及腦水腫的機制之一。

細胞凋亡是細胞程序性死亡的過程，在腦卒中后神經元細胞死亡中起重要作用。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族的成員之一，是一種細胞凋亡的執行蛋白，其表達量可以反映細胞凋亡程度。Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白。Bcl-2家族中促凋亡和抗凋亡成員之間的平衡調控細胞凋亡過程，常用Bax/Bcl-2來反映細胞凋亡情況[12]。本研究結果顯示，與假手術組比較，SAH組caspase-3、Bax蛋白表達及Bax/Bcl-2顯著增加，Bcl-2蛋白表達顯著降低，表明SAH后24 h可增加腦組織中的細胞凋亡。與SAH組比較，SAH+Dex組caspase-3、Bax蛋白表達及Bax/Bcl-2顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著增加，表明Dex可降低caspase-3、Bax表達以及Bax/Bcl-2，增加Bcl-2表達，這為Dex的抗凋亡作用提供了證據。我們推測，Dex可能通過調整小神經膠質細胞的亞型，調控炎癥因子(如TNF-α)的釋放，進而降低細胞凋亡。炎癥反應可加重細胞凋亡，研究認為TNF-α參與促凋亡過程[13]。因此，Dex降低SAH后TNF-α水平可能也是Dex抗凋亡的機制之一。

已有研究證實，交感神經系統(SNS)的激活與炎癥反應有關，而抑制SNS可降低炎性因子的釋放[14]。Dex作為腎上腺素2受體激動劑，其抗炎作用與抗交感神經系統活性有密切關系。一方面，Dex可與突觸后2腎上腺素能受體(2AR)結合，終止疼痛信號的釋放，抑制SNS血壓和心率升高，產生鎮靜、抗焦慮和鎮痛作用[15]。另一方面，Dex與突觸前2AR結合可抑制去甲腎上腺素的釋放，進而抑制免疫系統活性，阻止炎癥因子釋放，產生抗炎作用[16]。由于2AR廣泛分布于中樞和周圍神經系統以及其他器官組織，因此Dex可調控機體各個部分的炎癥反應，對全身具有麻醉、鎮靜、鎮痛作用。這可能也是Dex保護SAH后早期腦損傷的機制之一，但具體途徑還有待進一步研究。

綜上所述，本研究結果表明Dex對SAH后大鼠具有神經保護作用，其機制可能與修復血腦屏障，調整小神經膠質細胞的亞型，抑制促炎因子釋放，降低細胞凋亡有關。