水通道蛋白9在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)變化及其過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

軒福明，范仁根，蘇鳳連，查文章，鄒琳，秦呈林

(徐州醫(yī)科大學(xué)鹽城臨床學(xué)院，江蘇鹽城224000)

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率高、病死率高，嚴(yán)重威脅人們的生存質(zhì)量。手術(shù)及新輔助化療作為治療的主要手段，有效降低了結(jié)直腸癌的局部復(fù)發(fā)率，在一定程度上提高了患者生存期，但很多存在腹腔轉(zhuǎn)移的患者治療效果不佳，合并腹腔轉(zhuǎn)移者的5年生存率明顯低于未轉(zhuǎn)移者[1]。腫瘤的高侵襲轉(zhuǎn)移潛能是腫瘤難以根治的重要原因，研究顯示，上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[2]。水通道蛋白(AQP)是一組廣泛存在于真核和原核生物細(xì)胞膜上的選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異性孔道，參與細(xì)胞內(nèi)外水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)。文獻(xiàn)報(bào)道，AQP9參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移[3，4]，并可在一定程度上影響結(jié)腸癌的化療效果[5]。AQP9在結(jié)腸黏膜中表達(dá)，但其在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的研究鮮有報(bào)道。2018年1月～2019年1月，我們觀察了AQP9在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，并分析AQP9過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，探討其與EMT的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 結(jié)腸癌組織標(biāo)本來源 選擇鹽城市第一人民醫(yī)院2018年1月～2019年1月收治的33例結(jié)腸癌患者，男16例、女17例，年齡(65.0±10.7)歲。左半結(jié)腸癌24例、右半結(jié)腸癌9例?；颊呔邮苋的そY(jié)腸癌根治術(shù)(術(shù)前未行輔助化療)，取手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁組織，固定于4%甲醛溶液中，用石蠟包埋。術(shù)后病理檢查證實(shí)腫瘤組織為結(jié)腸腺癌、癌旁組織為正常腸組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購自南京凱基生物公司，羊抗小鼠IgG、抗AQP9兔多克隆抗體購自中國上海Sangon Biotech公司，pcDNA3.1購自武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物公司，Anti-Vimentin、Anti-E Cadherin、GAPDH購自中國Abcam公司，Transwell小室、基質(zhì)膠購自美國Corning公司、0.25% Tripsin-EDTA購自南京端粒公司、PVDF膜購自美國Millipore公司，ECL Plus發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、Western及IP細(xì)胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天公司。

1.2 結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中AQP9表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化IHC法。取結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織蠟塊，連續(xù)切3～5 μm厚切片，每個(gè)蠟塊切5張備用。置于65 ℃烘箱中1 h。加入二甲苯脫蠟，無水乙醇脫水，檸檬酸鹽緩沖液中煮沸10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，加入內(nèi)源性過氧化物酶封閉。加入一抗(抗AQP9兔多克隆抗體，稀釋濃度為1∶150)，4 ℃孵育過夜；加入二抗(山羊抗小鼠IgG-HPR)25 ℃孵育1 h。PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇、二甲苯脫水，中性樹脂封片。使用Image-Pro Plus軟件(Msdia Cyber netics, Rockville,MD,USA)隨機(jī)選擇3個(gè)高倍鏡(×400)視野，對(duì)陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。AQP9主要表達(dá)在結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，染色后呈棕黃色。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：<10%計(jì)1分，10%～50%計(jì)2分，50%～80%計(jì)3分，>80%計(jì)4分；陽性著色強(qiáng)度評(píng)分：無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘<3為陰性、≥3為陽性。

1.3 AQP9過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116細(xì)胞采用含10%的胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分為空白組、AQP9過表達(dá)組和空質(zhì)粒組。AQP9過表達(dá)組：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按5×104/孔接種于24孔板，37 ℃孵育24 h；當(dāng)細(xì)胞融合度在50%左右時(shí)，將0.8 μg過表達(dá)AQP9的質(zhì)粒和2 μL Lipo2000分別溶于50 μL Opti-mem無血清培養(yǎng)基中稀釋，靜置5 min，將兩管溶液混合，放置20 min。將24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)基更換成無血清培養(yǎng)基，每孔400 μL，并將配置的混合溶液加入24孔板中對(duì)應(yīng)位置，6 h后更換成有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h?？召|(zhì)粒組：采用pcDNA3.1代替過表達(dá)AQP9的質(zhì)粒，通過Lipo2000轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞，步驟與AQP9過表達(dá)組相同?？瞻捉M正常培養(yǎng)，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.3 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。將Matrigel基質(zhì)膠加入無血清培養(yǎng)基按1∶4稀釋，取50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃靜置4 h，使Matrigel聚合成凝膠。收集各組細(xì)胞，加入0.25%胰酶(含EDTA)消化，離心棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，用含0.2% BSA的無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL。取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室；下室加入600 μL含10% FBS培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，PBS沖洗，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。擦去上層未遷移的細(xì)胞，PBS沖洗。200倍顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取平均值。

1.3.4 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。收集各組細(xì)胞，加入0.25%胰酶(含EDTA)消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，培養(yǎng)過夜。用Marker筆在6孔板背后均勻劃橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔穿過3條線。加入細(xì)胞約5×105/孔，鋪滿過夜。用槍頭垂直于背后的橫線劃痕，PBS沖洗，加入無血清培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。于0、24 h取樣、拍照。隨機(jī)選取3個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，測(cè)量24 h時(shí)細(xì)胞遷移的剩余面積，取平均值。

1.3.5 細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育2 h。加入一抗(Anti-E-cadherin按1∶1 000稀釋、Anti-Vimentin按1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入二抗(HPR-山羊兔抗IgG按1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗膜。用ECL發(fā)光法顯色，Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。以GAPDH為參照，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌及癌旁正常組織中AQP9表達(dá)比較 AQP9在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率為33.33%(11/33)，在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為69.70%(23/33)，AQP9蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率低于癌旁正常組織(χ2=8.735，P<0.05)。

2.2 AQP9過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

2.2.1 三組細(xì)胞侵襲能力比較 AQP9過表達(dá)組、空質(zhì)粒組、空白組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(213±19)、(410±30)、(412±30)個(gè)，AQP9過表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)少于空質(zhì)粒組和空白組(P均<0.05)。

2.2.2 三組細(xì)胞遷移能力比較 AQP9過表達(dá)組、空質(zhì)粒組、空白組24 h細(xì)胞遷移剩余面積分別為(27 940±373)、(13 103±499)、(13 723±1 257)μm2，AQP9過表達(dá)組細(xì)胞遷移剩余面積少于空白組、空質(zhì)粒組(P均<0.05)。

2.2.3 三組細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 AQP9過表達(dá)組E-cadherin表達(dá)較空白組、空質(zhì)粒組升高，Vimentin表達(dá)較空白組、空質(zhì)粒組降低(P均<0.05)。見表1。

表1 三組細(xì)胞中AQP9、E-cadherin、Vimentin表達(dá)水平比較

注：與空白組、空質(zhì)粒組比較，*P<0.05。

3 討論

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年上升。手術(shù)是目前治療結(jié)腸癌的主要手段，手術(shù)切除技術(shù)的進(jìn)步依賴于更新手術(shù)的設(shè)備和概念，但手術(shù)切除的范圍是有限的，據(jù)最近一項(xiàng)美國國立癌癥研究所SEER數(shù)據(jù)庫分析，對(duì)于晚期結(jié)直腸癌，隨著手術(shù)方式的改進(jìn)對(duì)患者的存活率的影響有限，化療方案的進(jìn)展是CRC患者生存率提高的主要原因[6]。生物治療作為治療結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的新的治療模式，運(yùn)用生物技術(shù)和生物制劑影響腫瘤的發(fā)生、生長、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)重建，從而激發(fā)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的應(yīng)答，達(dá)到控制和消滅體內(nèi)微小殘留病灶甚至使晚期腫瘤得到部分或完全緩解。生物治療不僅沒有任何不良反應(yīng)，降低了患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的概率，一定程度上提高了患者對(duì)放化療的敏感性和耐受性。因此，尋找結(jié)腸癌的生物標(biāo)志物一直是臨床腫瘤學(xué)的熱點(diǎn)。

AQP是一種跨膜的膜孔通道蛋白，目前已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中鑒定出15種水通道蛋白基因，即AQP0～AQP14[7]。AQP9位于15號(hào)染色體(15p22)，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。AQP9蛋白對(duì)水、甘油、尿素以及一些中性小分子通透，參與細(xì)胞內(nèi)外水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，被認(rèn)為與結(jié)腸水運(yùn)動(dòng)有關(guān)[8]。在結(jié)腸，AQP9主要分布在腸黏膜的杯狀細(xì)胞的細(xì)胞膜，參與腸道系統(tǒng)的水代謝活動(dòng)[9，10]。已經(jīng)證實(shí)，AQP1、AQP5、AQP8與結(jié)腸癌有關(guān)[11，12]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中的AQP9陽性表達(dá)率低于癌旁組織，且其過表達(dá)后細(xì)胞侵襲能力、遷移能力較空白組、空質(zhì)粒組明顯下降，表明AQP9在結(jié)腸癌的生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移中同樣起著非常重要的作用。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移是造成結(jié)腸癌難以根治的重要原因。研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞自身的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的增加是通過在轉(zhuǎn)移的早期階段經(jīng)歷EMT實(shí)現(xiàn)的[13]。EMT是一種上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞過程，在此期間，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin上調(diào)，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin下調(diào)[14，15]。腫瘤細(xì)胞通過EMT過程，使上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性，失去與基底膜連接的上皮表型，獲得具有較高的遷移與侵襲能力的間質(zhì)表型[16]。本研究結(jié)果顯示，AQP9過表達(dá)組E-cadherin表達(dá)較空白組、空質(zhì)粒組升高，Vimentin表達(dá)較空白組、空質(zhì)粒組降低，表明AQP9過表達(dá)可誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)并抑制Vimentin表達(dá)，從而抑制上皮來源的腫瘤細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變。由于EMT導(dǎo)致的這種表型的轉(zhuǎn)變是腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，其過程被抑制后，轉(zhuǎn)移能力隨之下降，因此AQP9過表達(dá)可抑制結(jié)腸癌的侵襲和遷移能力，其機(jī)制可能是通過抑制EMT來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中AQP9表達(dá)降低；AQP9過表達(dá)可抑制結(jié)腸癌的侵襲和遷移能力，其機(jī)制可能是通過抑制EMT來實(shí)現(xiàn)的。檢測(cè)AQP9的變化可能為早期診斷提供參考，而AQP9相關(guān)制劑的研究可能為靶向治療提供新的選擇。