腋窩淋巴結轉移與無轉移乳腺浸潤性導管癌患者癌組織中差異表達蛋白的篩選與驗證

楊亮，許文婷，趙倩，吳濤，迪力夏提·金汗，李丹，杜露，王波，朱麗萍

(新疆醫科大學第三臨床醫學院附屬腫瘤醫院，烏魯木齊830011)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌轉移及復發是導致乳腺癌患者死亡的主要原因。目前對乳腺癌的分子生物學機制已有很多研究，但是仍然缺乏針對乳腺癌轉移和復發有效控制的方法。尋找乳腺癌患者復發、轉移的關鍵基因和蛋白，對指導個體化治療、提高患者的生存率具有重要意義。腋窩腋淋巴結是否轉移是制定乳腺癌治療方案的重要參考依據，也是乳腺癌重要的獨立預后影響因子[1]。乳腺浸潤性導管癌約占乳腺癌的70%，部分類型惡性程度較高。本研究采用蛋白質組學技術分析腋窩淋巴結轉移和未轉移乳腺浸潤性導管癌患者癌組織中的差異表達蛋白，尋找可能在乳腺癌淋巴結轉移過程中起關鍵作用的蛋白，為篩選新的治療靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月～2018年1月我院收治的原發乳腺浸潤性導管癌患者12例，均為女性，年齡25～48歲，其中腋窩淋巴結轉移7例、腋窩淋巴結未轉移5例。納入標準：經病理檢查確診為乳腺浸潤性導管癌；入院前未行放療、化療、手術、生物靶向及內分泌等治療；KPS≥80分，能夠接受乳腺癌改良根治術治療；無其他臟器系統惡性腫瘤病史。排除標準：導管原位癌及小葉原位癌、乳腺浸潤性小葉癌；入院后B超檢查提示為多灶性乳腺癌；乳腺轉移腫瘤及其他特殊類型乳腺腫瘤(如家族性乳腺癌、遺傳性乳腺癌、乳腺肉瘤、男性乳腺癌、炎性乳腺癌、妊娠期乳腺癌、乳腺淋巴瘤、微乳頭狀癌等)。術中留取乳腺癌組織、距癌組織病灶≥3 cm的癌旁組織和正常乳腺組織(距離癌旁病灶≥5 cm)，加入液氮中速凍，-80 ℃保存，用于差異蛋白的篩選。另取我院病理科保存的2016～2018年乳腺浸潤性導管癌組織164例，用于差異表達蛋白的免疫組化驗證。患者年齡28～72(46.71±11.28)歲，其中腋窩淋巴結轉移66例、腋窩淋巴結未轉移98例，轉移和無轉移患者的年齡、TNM分期、是否絕經差異無統計學意義(P均>0.05)，腫塊大小、分子分型差異有統計學意義(P均<0.01)。見表1。本研究經醫院倫理委員會審核批準，患者均簽署知情同意書。

表1 腋窩淋巴結轉移與無轉移的乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理資料比較(例)

1.2 差異表達蛋白的篩選

1.2.1 樣品制備與總蛋白提取 取12例乳腺癌組織、癌旁組織和正常乳腺組織標本，清洗后剪碎，加入液氮研磨成粉末。放入EP管中，加入裂解液，離心取上清液。采用BCA法進行總蛋白定量分析，分裝于EP管中，-80 ℃保存。

1.2.2 組織蛋白的分離 取50 μg蛋白樣品與水化液混合，準備蛋白質分子量參照標準物。二維凝膠電泳上樣，等電聚焦結束后，將IPG膠條置于平衡緩沖液中均衡，再將膠條轉入垂直電泳槽中，進行第二向電泳，然后用硝酸銀染色，分析電泳后蛋白位點。每種組織蛋白樣品重復3個膠板。將圖像分析得到的蛋白差異位點從凝膠上切除，沖洗，脫色，脫水，進行酶解反應后進行質譜分析。

1.2.3 差異表達蛋白位點的定量分析 采用Image Master 2D-Platinum 5.0圖像分析軟件對乳腺癌組織和癌旁組織差異表達的蛋白位點進行對比、定量分析。以癌旁組織和正常乳腺組織標本做對照，排除個體差異的影響，篩選標記蛋白位點。分析蛋白位點的差異倍數，兩組蛋白表達量的差異倍數>2.0或<0.5且具有重復性時認為是差異蛋白位點。

1.2.4 差異表達蛋白的鑒定 采用二維凝膠電泳結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MELDI-TOF-MS)對篩選出來的差異蛋白位點進行質譜鑒定，通過檢索數據庫確定蛋白名稱及功能。

1.3 差異表達蛋白的驗證 應用免疫組化SP法檢測164例乳腺浸潤性導管癌組織中差異蛋白的表達。由3位病理專家采用雙盲法對免疫組化結果進行評分：①對陽性細胞占總細胞的比例進行評分，無為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，81%～100%為4分。②對陽性細胞染色強度進行評分，陰性為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強陽性為3分。將上述兩項評分相加，總分0～3分為陰性，4～7分為陽性。

2 結果

2.1 乳腺癌、癌旁組織和正常乳腺組織的二維電泳圖譜分析結果 正常乳腺組織二維電泳圖譜可辨識約3 500個蛋白位點，乳腺癌組織得到(3 689±64)個蛋白位點，癌旁組織得到(3 562±89)個蛋白位點。腋窩淋巴結轉移及未轉移乳腺浸潤性導管癌組織得到(3 781±78)、(3 475±86)個蛋白位點。

2.2 腋窩淋巴結轉移乳腺癌組和淋巴結未轉移乳腺癌組差異性蛋白篩選結果 通過對腋窩淋巴結轉移乳腺癌組與淋巴結未轉移乳腺癌組中癌組織對比分析，排除癌旁及正常乳腺組織配對分析得出差異蛋白影響，最終得出87個差異蛋白位點，其中表達上調47個、表達下調40個。比較兩者差異蛋白位點序號及差異倍數，淋巴結轉移乳腺癌組織中高表達的蛋白前3位為核基質結合區結合蛋白1(SATB1)、埃茲蛋白(Ezrin)、微管解聚蛋白(Stathmin)，低表達的蛋白前3位分別是鈣黏附蛋白(E-cadherin)、Maspin蛋白、腫瘤轉移抑制基因蛋白(KAI-1)。乳腺癌組織中差異表達蛋白位點質譜分析見圖1。

圖1 乳腺癌組織中差異表達蛋白質譜分析圖

2.3 腋窩淋巴結轉移和未轉移乳腺癌組織中的差異表達蛋白驗證結果 腋窩淋巴結轉移乳腺癌組織Ezrin、Stathmin蛋白表達陽性率高于未轉移乳腺癌組織，E-cadherin蛋白表達陽性率低于未轉移組織(P均<0.05)。見表2。

表2 腋窩淋巴結轉移與未轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中差異表達蛋白檢測結果比較(例)

3 討論

乳腺癌的進展是一個復雜的過程，一些蛋白如Bmi-1、EZH2蛋白在乳腺癌轉移過程中發揮了一定作用[2]，這些蛋白引起乳腺癌轉移的機制是腫瘤研究的熱點。乳腺癌疾病進展出現腋窩淋巴結轉移，淋巴結轉移將影響乳腺癌的預后。本研究采用二維凝膠電泳的方法分離乳腺浸潤性導管癌組織內蛋白質，分析腋窩淋巴結轉移和未轉移者的差異表達蛋白，通過對差異性蛋白位點的鑒定，尋找可能在乳腺癌疾病發展及轉移過程中起到關鍵作用的蛋白。

本研究發現，合并腋窩淋巴結轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中，有幾類蛋白表達出現了明顯變化。其中黏附蛋白表達差異最為明顯，在淋巴結轉移組高表達的蛋白有SATB1、Ezrin、Stathmin，低表達蛋白有E-cadherin、Maspin、KAI-1。部分蛋白在乳腺癌中差異表達，已有文獻[3～5]報道證實。經過免疫組化驗證，Stathmin、Ezrin、E-cadherin蛋白在兩組乳腺癌癌組織標本中表達異常。這些蛋白可能在乳腺癌發生轉移過程中起重要作用。

SATB1蛋白與乳腺癌的生長、轉移及預后等有密切的關系[6]。SATB1蛋白表達能誘導細胞的侵襲表型，從而促進腫瘤的生長和轉移[7]。研究發現，在有淋巴結轉移乳腺癌組中SATB1蛋白表達量高。本研究結果顯示，在淋巴結轉移乳腺癌組和淋巴結未轉移乳腺癌組中SATB1蛋白表達并無差異，可能因為標本量偏小出現偏倚，需要后續擴大樣本含量或者采用蛋白質印跡法進一步研究。

E-cadherin位于細胞膜上，是一種重要的細胞黏附糖蛋白，是細胞生長的接觸抑制劑，能夠抑制瘤細胞侵襲轉移[8]。文獻報道，腫瘤細胞發生上皮間葉轉化，E-cadherin表達降低、功能缺失，細胞膜間黏附力下降、丟失極性，癌細胞可脫離癌巢，出現遠處轉移。研究顯示，E-cadhenrin在多種腫瘤的功能缺失與腫瘤的轉移及預后有密切聯系[9,10]。

Ezrin蛋白是一種酪氨酸激酶的底物，能在細胞膜蛋白與肌動蛋白骨架之間起到橋梁作用。Ezrin蛋白與乳腺癌細胞的黏附、凋亡、增殖、侵襲轉移相關，并參與腫瘤血管生成的調節[11]。本研究結果顯示，乳腺癌組織Ezrin表達水平高于癌旁正常組織，表明Ezrin高表達可促進乳腺癌的發生發展，檢測乳腺癌組織Ezrin表達有助于乳腺癌的早期診斷和病情評估。

Stathmin是一種高度保守的細胞質蛋白，通過被蛋白激酶磷酸化影響微管形成及細胞有絲分裂過程，調節細胞周期，從而影響細胞的增殖、分化及功能。Stathmin蛋白與乳腺癌的發生發展密切相關，還與乳腺癌的分化程度及增殖有關。艾冬梅等[12]認為，Stathmin是乳腺癌發生的重要因子，可能成為乳腺癌早期診斷、判斷預后及基因治療的新靶點。

Maspin基因是一種抑癌基因，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員。文獻報道，Maspin存在于正常的上皮組織如乳腺導管上皮、口腔黏膜上皮、胃腸道黏膜上皮中,在正常組織中Maspin呈現高水平表達，在惡性腫瘤中其含量明顯降低[13],在乳腺癌組織中呈低表達。

腫瘤抑制因子KAI-1在許多癌癥中被下調或丟失并與預后不良有關。研究發現,乳腺癌組織中KAI-1蛋白陽性表達顯著低于正常乳腺組織，提示在乳腺癌組織中存在KAI-1表達下降或缺失，特別是在伴淋巴結轉移、遠處臟器轉移腫瘤中的表達較非轉移者比較明顯降低[14]。

綜上所述，腋窩淋巴結轉移與未轉移的乳腺浸潤性導管癌在組織蛋白表達上存在很多差異，提示乳腺癌的淋巴結轉移過程是多種蛋白共同作用的結果。對轉移相關蛋白進行研究有助于闡明蛋白質在乳腺癌腋窩淋巴結轉移中的作用，進一步闡明腫瘤轉移的機制。