人AFP啟動(dòng)子操控的跨膜型抗CD3單鏈抗體構(gòu)建及其在AFP陽(yáng)性肝癌細(xì)胞中特異性表達(dá)

祁麟，熊夢(mèng)裳，林芳珍，盧楊，熊冬生，張硯君，范冬梅，張晴

(1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液病醫(yī)院 血液學(xué)研究所，天津300020；2國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院 北京市兒科研究所)

目前，手術(shù)切除和肝移植仍是肝癌的主要治療手段，但患者的整體預(yù)后不佳，5年生存率不足6%[1]。近年來(lái)，腫瘤免疫治療成為研究熱點(diǎn)，腫瘤疫苗、過(guò)繼性細(xì)胞治療和免疫檢查點(diǎn)抑制劑備受矚目，但其針對(duì)實(shí)體瘤如肝癌的療效較為有限[2]。因此，亟待尋找能高效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的免疫治療新方法。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)可以通過(guò)抗CD3單克隆抗體(antiCD3scfv)有效裂解含F(xiàn)c受體的靶細(xì)胞[3]。Mentzer等[4]將antiCD3scfv插入腫瘤細(xì)胞膜表面時(shí)，CTL可對(duì)小鼠的多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生較好的殺傷效果；基于此原理設(shè)計(jì)的antiCD3scfv在腫瘤細(xì)胞膜上穩(wěn)定表達(dá)，也可調(diào)動(dòng)淋巴細(xì)胞的殺傷活性[5]。2018年2～11月，我們?cè)O(shè)計(jì)膜結(jié)合型antiCD3scfv,并將其構(gòu)建至復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad-5中，用腺病毒感染修飾人肝癌細(xì)胞；為了提高治療靶向性，我們以肝癌特異性人甲胎蛋白啟動(dòng)子(hAFPp)操控antiCD3scfv基因表達(dá)，使其僅在AFP陽(yáng)性(AFP+)肝癌細(xì)胞中表達(dá)，為肝癌的靶向治療研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 AFP+人肝癌細(xì)胞HepG2、Huh-7，AFP陰性(AFP-)正常人肝細(xì)胞HL-7702、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，感受態(tài)細(xì)胞為人胚胎腎細(xì)胞293A、293T，均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。PCR引物由Invitrogen公司合成，pMD19-T Simple載體、大腸桿菌DH5α購(gòu)自Takara公司，pUp-AFP克隆載體購(gòu)自賽業(yè)生物科技有限公司，大腸桿菌BJ5183由本實(shí)驗(yàn)室凍存。鼠抗人流感病毒血凝素(HA)表位標(biāo)簽單克隆抗體、APC標(biāo)記山羊抗鼠IgG H&L多克隆抗體、FITC標(biāo)記兔抗綠色熒光光蛋白(GFP)單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Cell Signal Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1 表達(dá)載體pGL3-hAFPp構(gòu)建 以pUp-AFP質(zhì)粒為模板，以hAFPp上游引物5′-ATCGCTCGAGTGATAAAATCCAGATTCAGTC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))、下游引物5′-ATCGAAGCTTTGTTTGAGGTTGCTAGTG-3′(下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn))擴(kuò)增hAFPp序列，并在兩端引入XhoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)以連接pGL3-Basic質(zhì)粒載體(含熒光素酶報(bào)告基因)。將擴(kuò)增的hAFPp片段克隆至以熒光素酶Luciferase為下游報(bào)告基因的質(zhì)粒pGL3-Basic中，構(gòu)建pGL3-hAFPp質(zhì)粒。菌液PCR初步鑒定后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑取單克隆測(cè)序鑒定。

1.2.2 hAFPp特異轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè) 將構(gòu)建的pGL3-hAFPp載體與對(duì)照載體pGL3-Basic、pGL3-control按2 μg/孔接種，用Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至1 μg/100 μL，分別轉(zhuǎn)染HepG2、Huh-7、HL-7702、MCF-7細(xì)胞；同時(shí)每孔加入50 ng表達(dá)海腎熒光素酶報(bào)告基因Renilla的載體pRL-TK作為內(nèi)參，以排除不同細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞狀態(tài)等因素的干擾。轉(zhuǎn)染后48 h按Promega熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，先后加入100 μL螢火蟲熒光素酶底物L(fēng)ARⅡ和100 μL海腎熒光素酶底物Stop & Glo Reagent，通過(guò)fLuc熒光素酶活性/Renilla熒光素酶活性計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性。其中pGL3-Basic質(zhì)粒fLuc上游不含啟動(dòng)子，作為陰性對(duì)照，并用于排除細(xì)胞背景信號(hào)；pGL3-control質(zhì)粒fLuc上游是CMV啟動(dòng)子，可作為啟動(dòng)子活性陽(yáng)性對(duì)照；以細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGL3-control數(shù)值為100%，對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染其余兩種載體數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到相對(duì)熒光活性百分比。

1.2.3 pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭質(zhì)粒載體構(gòu)建 以本實(shí)驗(yàn)室前期鑒定及構(gòu)建的pAZY-CD3質(zhì)粒為模板，用antiCD3scfv基因上游引物5′-ATCGAGATCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGTC-3′(下劃線為BglⅡ酶切位點(diǎn))、下游引物5′-ATCGGTCGACCCGTTTCAGCTCCAGCTTG-3′(下劃線為SalⅠ酶切位點(diǎn))擴(kuò)增“信號(hào)肽(SP)-antiCD3scfv-跨膜肽(TM)”序列，構(gòu)建鑒定正確的pDisPlay-SP.antiCD3scfv.TM中間載體。經(jīng)酶切位點(diǎn)EcoRⅤ和NotⅠ酶切pDisPlay-SP.antiCD3scfv.TM中間載體；經(jīng)酶切位點(diǎn)XhoⅠ和EcoRⅤ酶切pUp-AFP質(zhì)粒，構(gòu)建pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭質(zhì)粒載體，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.3 腺病毒的重組、包裝及滴度測(cè)定

1.3.1 腺病毒重組 腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1、大腸桿菌BJ5183由本實(shí)驗(yàn)室保存，制備含pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞。將鑒定正確的pAd-hAFPp-antiCD3scfv質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶PmeⅠ進(jìn)行線性化，并轉(zhuǎn)化至上述感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定重組成功。

1.3.2 腺病毒包裝 常規(guī)培養(yǎng)293A細(xì)胞，至融匯度達(dá)到80%時(shí)消化；調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×105/mL，接種于24孔培養(yǎng)板繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。將羅氏X-tremeGENE DNA轉(zhuǎn)染試劑、無(wú)菌pAd-hAFPp-antiCD3scfv線性化質(zhì)粒、Opti-MEM按說(shuō)明書制備成DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，分別加入293A培養(yǎng)孔，輕柔混勻后常規(guī)培養(yǎng)10～14 d，至293A細(xì)胞全部變圓漂起產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。反復(fù)凍融并震蕩細(xì)胞，使胞內(nèi)病毒徹底釋放；收集第1、2、3代病毒懸液并命名為AdCD3scfv，平行設(shè)置腺病毒pAdTrack作為空白對(duì)照，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 腺病毒滴度測(cè)定 病毒儲(chǔ)存液用含2% FBS的無(wú)抗生素高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋為107～1016，使用接種293A細(xì)胞的96孔板分別加入以上10個(gè)稀釋梯度的病毒儲(chǔ)存液，常規(guī)培養(yǎng)10 d后置于熒光顯微鏡下觀察。按照TCID50方法測(cè)定重組腺病毒滴度，AdCD3scfv滴度為1.58×1011PFU/mL、AdTrack滴度為1.26×1012PFU/mL，兩者均取2×107PFU/mL 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 antiCD3scfv對(duì)肝癌細(xì)胞的特異修飾及活性檢測(cè)

1.4.1 antiCD3scfv蛋白表達(dá)情況檢測(cè) 采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2、Huh-7、HL-7702、MCF-7細(xì)胞，按2×105/孔接種6孔板，每種細(xì)胞接種2孔。分別加入終濃度為2×107PFU/mL的AdCD3scfv(100 MOI)和2×107PFU/mL的空載對(duì)照腺病毒AdTrack(100 MOI)。收集各感染細(xì)胞蛋白，Western blotting法檢測(cè)antiCD3scfv蛋白。

1.4.2 antiCD3scfv蛋白表達(dá)定位檢測(cè) 采用免疫熒光法。以AdCD3scfv和AdTrack感染上述4種細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，經(jīng)多聚甲醛固定后封閉；加一抗(鼠源抗HA標(biāo)簽抗體)、二抗(APC標(biāo)記山羊抗鼠IgG H&L多克隆抗體)孵育，以免疫熒光法對(duì)目的蛋白進(jìn)行定位。

1.4.3 腺病毒感染及跨膜antiCD3scfv的表達(dá)效率測(cè)算 采用流式細(xì)胞儀。于100 MOI條件下，再次以AdCD3scfv和AdTrack感染上述4種細(xì)胞，一抗、二抗孵育同1.4.2，用流式檢測(cè)各種細(xì)胞GFP陽(yáng)性率及HA標(biāo)記anti-CD3scfv蛋白表達(dá)水平，評(píng)價(jià)腺病毒感染及跨膜antiCD3scfv的表達(dá)效率。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

2.1.1 表達(dá)載體pGL3-hAFPp的構(gòu)建結(jié)果 通過(guò)PCR從pUP-AFP克隆載體中克隆人—鼠嵌合型AFP啟動(dòng)子，符合預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量2 810 bp(封三圖1A)；在構(gòu)建成的質(zhì)粒pGL3-hAFPp中，選取菌液PCR陽(yáng)性克隆小提質(zhì)粒(封三圖1B)，雙酶切再次鑒定正確的克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定后序列正確(封三圖1C)。

2.1.2 hAFPp特異轉(zhuǎn)錄活性分析結(jié)果 hAFPp在AFP+的HepG2、Huh-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性分別為160.86%±26.24%、80.08%±12.64%，而在AFP-細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性均<7%(P均<0.05)。pGL3-Basic在這4種細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性介于0.1%～1%(P均<0.05)，表明各個(gè)樣本間實(shí)驗(yàn)背景基本一致。見表1。

表1 pGL3-hAFPp、pGL3-Basic轉(zhuǎn)染不同類型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性比較

注：與AFP-細(xì)胞轉(zhuǎn)染同類型載體比較，*P<0.05。

2.1.3 pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭質(zhì)粒載體構(gòu)建結(jié)果 克隆得到SP.antiCD3scfv.TM序列，符合預(yù)期性對(duì)分子質(zhì)量1 023 bp(封三圖2A)；EcoRⅤ和NotⅠ雙酶切pAdTrack-hAFPp質(zhì)粒(封三圖2B),成功構(gòu)建pAdTrack-hAFPp質(zhì)粒；陽(yáng)性克隆(封三圖2C)經(jīng)測(cè)序公司測(cè)序?yàn)檎_的pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭質(zhì)粒載體，經(jīng)雙酶切再次鑒定正確(封三圖2D)。

2.2 antiCD3scfv對(duì)肝癌細(xì)胞的特異修飾及活性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 antiCD3scfv蛋白表達(dá)情況 在AdCD3scfv感染的細(xì)胞中，僅HepG2、Huh-7細(xì)胞中檢測(cè)到antiCD3scfv蛋白表達(dá)(36.7 kD)，而HL-7702、MCF-7均無(wú)條帶出現(xiàn)。AdTrack做為空載對(duì)照，在上述4種細(xì)胞中均無(wú)目的蛋白表達(dá)。見封三圖3。

2.2.2 antiCD3scfv蛋白表達(dá)定位情況 AdTrack感染后，4種細(xì)胞均未見目的蛋白表達(dá)，AdCD3scfv感染后，僅在HepG2、Huh-7細(xì)胞見antiCD3scfv蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜表面(紅色熒光)，而HL-7702、MCF-7細(xì)胞未見antiCD3scfv蛋白表達(dá)。見封三圖4。

2.2.3 各類細(xì)胞腺病毒感染及跨膜antiCD3scfv表達(dá)效率 AdCD3scfv及AdTrack對(duì)4種細(xì)胞病毒感染效率(GFP+細(xì)胞比率)均>95%，證明100 MOI為合適的病毒感染復(fù)數(shù)；但僅在AdCD3scfv感染的HepG2、Huh-7細(xì)胞中GFP+antiCD3scfv+細(xì)胞群比例>90%，高于AdCD3scfv感染的HL-7702、MCF-7及AdTrack感染的4種細(xì)胞(P均<0.05)。見表2。

表2 各類細(xì)胞腺病毒感染后跨膜GFP+ antiCD3scfv+細(xì)胞比率比較

注：與感染AdTrack同類型細(xì)胞比較，*P<0.05；與AFP-細(xì)胞轉(zhuǎn)染同類型載體比較，#P<0.05。

3 討論

腫瘤抗原是癌癥免疫治療的核心，至今已經(jīng)鑒定的可被T細(xì)胞靶向的幾種肝癌特異性腫瘤相關(guān)抗原(TAA)有癌胚抗原(AFP、GPC3)、過(guò)表達(dá)抗原(TERT)、腫瘤睪丸抗原(MAGE-A、SSX-2、NY-ESO-1)等[6]。肝癌作為一種極其特異質(zhì)性的腫瘤，在其內(nèi)部并非所有腫瘤細(xì)胞都表達(dá)相同的抗原[7]，而免疫系統(tǒng)對(duì)缺乏抗原或者抗原表達(dá)不強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞具有選擇性壓力，這些腫瘤細(xì)胞將逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，并最終導(dǎo)致腫瘤重塑，或稱為“免疫編輯”。通過(guò)此類機(jī)制形成的新生腫瘤內(nèi)部極度缺乏抗原，這使肝癌的免疫治療面臨著更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

研究發(fā)現(xiàn)，70%以上的肝癌細(xì)胞會(huì)大量表達(dá)一種大分子糖蛋白AFP。AFP本身在胎兒肝細(xì)胞中大量表達(dá)，出生后合成停止；但當(dāng)肝細(xì)胞癌變時(shí)，其抗原基因被激活，可重新產(chǎn)生大量的AFP[8]。因此，AFP啟動(dòng)子已成為靶向肝癌的基因治療研究中常用的轉(zhuǎn)錄特異性啟動(dòng)子元件，特別是在很多以腺病毒為載體的基因治療研究中，該啟動(dòng)子都被用來(lái)驅(qū)動(dòng)下游治療基因的表達(dá)[9]；此外，利用抗體直接作用于T細(xì)胞表面的CD3分子向下游傳遞活化信號(hào)，可調(diào)動(dòng)淋巴細(xì)胞的殺傷活性[10]。以antiCD3scfv改造修飾腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，可以繞過(guò)抗原表達(dá)或者M(jìn)HC抗原提呈的局限。因此，本研究選用了hAFPp操控antiCD3scfv的表達(dá)，達(dá)到控制腺病毒只在感染肝癌細(xì)胞后才能啟動(dòng)antiCD3scfv特異性表達(dá)的目的，而不影響可能被感染的正常細(xì)胞，進(jìn)一步增強(qiáng)這個(gè)基因治療體系的特異性。

根據(jù)以上思路，本研究將跨膜型antiCD3scfv基因構(gòu)建至Ad-5腺病毒載體中，以腺病毒感染修飾人肝癌細(xì)胞。為了提高治療靶向性，減少對(duì)正常細(xì)胞的潛在損傷，本研究又設(shè)計(jì)以肝癌特異性hAFPp操控antiCD3scfv基因，使其只有在AFP+肝癌細(xì)胞中才能表達(dá)。通過(guò)免疫熒光與流式分析發(fā)現(xiàn)，antiCD3scfv蛋白成功表達(dá)在細(xì)胞膜表面，并且僅表達(dá)于AFP+的肝癌細(xì)胞HepG2及Huh7中，也再次證明hAFPp的特異轉(zhuǎn)錄活性和肝癌特異性。

腫瘤細(xì)胞膜表面antiCD3scfv的表達(dá)密度決定淋巴細(xì)胞的活化程度。提高腫瘤內(nèi)部新生腺病毒的生物利用度，增加antiCD3scfv的表達(dá)，即可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化，又可強(qiáng)化免疫反應(yīng)。Bhattacharyya等[11]研究發(fā)現(xiàn)，5-FU可以改變宿主細(xì)胞表面腺病毒內(nèi)化所需關(guān)鍵受體的表達(dá)水平，主要表現(xiàn)為CAR、αvβ3和αvβ5整合素表達(dá)的升高，從而增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)腺病毒的攝取能力。因此，在本研究的基礎(chǔ)上聯(lián)合5-FU，理論上可以促進(jìn)新生腺病毒對(duì)肝癌細(xì)胞的感染效率并評(píng)價(jià)免疫治療效果的改善，這也是本研究下一步準(zhǔn)備著手開展的工作。