Crtacl在芬太尼誘導下痛覺過敏機制研究

金宇 陳恒玲 林顯光

摘要：指出了阿片類藥物誘導的痛覺過敏（Opioid-induced hyperalgesia，OIH）是臨床上的一個棘手問題，由于其發生機制尚不明確，故目前還沒有一種良好的治療方法。背根神經節（Dorsal root ganglia，DRG）是感覺傳遞的初級神經元所在部位，是機體疼痛信號處理乃至編碼和傳遞的重要部位。已有研究認為阿片誘導的痛覺過敏也涉及DRG，但DRG參與阿片誘導的痛覺過敏的具體機制不詳。為此，在動物模型的基礎上篩選出了可能參與痛覺過敏發生的基因Crtacl，對其參與大鼠痛覺過敏的機制分別開展了初步的研究。首先，在大鼠頸部皮下反復注射枸櫞酸芬太尼構建OIH模型，通過甲基化測序發現Crtacl在OIH組的DRG中與對照組的有顯著差異。其次，通過半定量PCR發現Crtacl基因表達量在OIH大鼠的DRG中明顯上調，這說明Crtacl可能在DRG水平上參與著痛覺過敏的發生。針對在DRG上參與OIH的調控作用進行的研究，有助于研究OIH的發生機制和信號通路，提供新的潛在治療OIH的藥物靶點。

關鍵詞：OIH;芬太尼;背根神經節;基因Crtacl

中圖分類號：Q71 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）20-0144-03

1引言

在日常生活中，疼痛一直都是非常令人討厭的，但是當身體發生疾病或者處于危險境況的時候，它卻提供了明確的危險信號。一直以來，疼痛的感知和傳遞都是重要的研究對象。臨床上，阿片類藥物常被作為手術過程中的麻醉劑，其鎮痛效果十分明顯。但是，停藥數小時以后往往會出現一個與其鎮痛效果相矛盾的現象，鎮痛效應轉變為痛敏效應。研究者把這個現象稱為阿片類藥物誘導的痛覺過敏（opioid-induced hyperalge-sia，OIH）。OIH是目前臨床上難以解決的問題，有關OIH的信號通路和發生機制仍然很不明確。背根神經節（Dorsal root ganglia，DRG）細胞可以對外周傷害性疼痛信號進行處理和傳遞，它在疼痛的研究中一直扮演著重要角色，在探究痛敏形成機制和痛覺傳導機制時都離不開DRG細胞。

通過甲基化測序篩選芬太尼誘導痛覺過敏在大鼠DRG中的相關基因，發現相比于對照組Crtacl這個基因在0IH組有明顯上調，其p值為0.0167，LogFC值為-1.92217，甲基化測序結果如圖1所示。

Crtacl（軟骨酸性蛋白1）是人類軟骨組織的細胞外基質蛋白，也存在于眼睛和神經系統中。Crtacl在脊椎動物、非脊椎動物等真核生物以及一些原核生物中表達，并在生物進化的過程中被保留下來，表明它具有十分重要的作用。Crtacl的結構模型顯示，它屬于β類蛋白，且族哺乳動物的某些疾病，包括阿爾茨海默癥等淀粉樣蛋白病相關。近年來也有研究表明Crtacl與人類晶狀體上皮細胞凋亡關系密切，且可能成為白內障治療的新靶點。然而目前有關痛覺過敏的文獻中很少見對這個基因的研究和探討。在痛覺過敏的研究中，將OIH與DRG聯系在一起進行研究的也并不多。本研究通過PCR技術確定Crtacl基因在mRNA水平上的表達差異，旨在為研究OIH發生機制提供一些參考并為治療OIH提供新的可能的靶點和方法。

2材料與方法

2.1實驗材料

本課題使用的實驗動物均來自湖北疾控中心實驗動物中心，為無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）的Sprague Dawley（SD）實驗大鼠，體重60～80g。實驗期間動物房溫度保持23士2℃，光照一黑暗時間12～12h，期間自由進食飲水，保證實驗動物處于健康且安靜的狀態。實驗動物的飼養方法和條件、使用及處死均符合有關法律和規章的要求。在大鼠頸部皮下反復注射枸櫞酸芬太尼構建OIH模型后，該模型鼠用于背根神經節RNA提取及后續的半定量PCR實驗。

2.2痛覺過敏模型的制備

參考文獻提供的方法，測量SD大鼠機械刺激縮足閾（PWMT，g）。選取痛閾均在正常水平的大鼠，造模前一天隨機將大鼠分成對照組和痛覺過敏組，對兩組大鼠進行上述痛閾測定（DO值）。痛覺過敏組在大鼠頸部進行皮下注射枸櫞酸芬太尼注射液，從而制備OIH動物模型。單次注射劑量為60ug/kg，每隔15min注射一次，共四次，總注射劑量為240ug/kg。對照組在頸部進行皮下注射，以相同的時間間隔注射與痛覺過敏組相同體積（約1.2mL/kg）的生理鹽水。

2.3總RNA的提取和cDNA的制備

參考文獻[11，12]提供的標準實驗流程，用TRIzol法提取總RNA。紫外分析RNA樣品，計算其A260/A280、A260/A230的值。一般認為，質量高的RNA樣品，A260/A280應為1.8～2.0，A260/A230應大于2.0。經分析合格后，每個樣品中加1uL RRI（RNA酶抑制劑）后，-80℃保存備用。

以總RNA為模板，按照擎科GoldenstarTM RT6cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。反應結束后將得到的cDNA模板置于-20℃中保存。

2.4半定量PCR（Reverse Transcription PCR。RT-PCR）分析

半定量PCR的引物由Primer 5設計，內參基因為Hprtl，表1為RT-PCR的反應引物序列。

按表2加入各組分。實驗的先決條件是將內參基因Hprt調平，通過調整加樣量，使整個反應體系中對照組和實驗組的cDNA模板量一致，進而比較目的基因表達量的差異。

結合Primer 5給出的退火溫度（Tm值）設定不同的階梯溫度進行一次PCRl3，根據結果分析選用最適宜的退火溫度。最終按照如表3的條件進行擴增。

3結果與分析

3.1利用芬太尼制備大鼠痛覺過敏模型。并在不同時

間點對其機械痛進行測量。與對照組進行比較

對比Saline組來看，大鼠頸部皮下注射芬太尼之后的4h內，Fentanyl組大鼠的機械痛閾（PWMT）明顯升高（P<0.001），芬太尼表現為明顯的鎮痛效應;從第5個小時開始，Fentanyl組大鼠的PWMT的值便開始下降，持續的在5h、6h、7h、8h、9h、12h、D1、D2、D3中均明顯的有下降趨勢（P<0.05），且在6.5h時出現了機械痛閾和熱痛閾值的最低點（P<0.001），此時芬太尼誘導的痛覺過敏現象最為明顯;由第4天（D4）開始，Fenta-nyl組大鼠的痛閾開始回升，其PWMT的值與Saline組相比，差異不具有統計學意義（P>0.05），直到第5天（D5）測量結束，二者均沒有反彈跡象，認為其痛閾已恢復至正常水平。結果展示見圖2。

3.2Hmgcs2基因在痛覺過敏大鼠的DRG中mRNA表達量的變化

將大鼠進行隨機分為兩組，一組注射生理鹽水為Control組，一組注射芬太尼為OIH組，注射方式見本文2.2小節。在確認造模成功后立即將大鼠的DRG急性分離，快速進行RNA提取，進行逆轉錄和半定量PCR。以Hprtl為內參基因，實驗結果如圖3所示，在mRNA水平上，基因Crtacl在OIH大鼠的DRG中表達量上調。

4結論與展望

一直以來，疼痛都是人類健康的最大“敵人”之一，也嚴重的影響著人類的生活質量。而人們也一直沒有停止與之對抗，隨著越來越深入的研究報道，越來越多治療疼痛的新的藥物靶點被發現，而臨床上用于鎮痛的“金標藥”依舊是阿片類藥物。但是使用阿片類藥物所帶來的痛覺過敏癥狀依舊是一個棘手的問題。所以，本課題成功構建芬太尼誘導的大鼠痛覺過敏模型，并以此模型為基礎進行后續實驗研究。對大鼠DRG進行提取，通過甲基化測序篩選出在OIH狀態下具有顯著性差異的基因Crtacl。將成功造模后的大鼠急性分離DRG提取RNA進行PCR實驗，可以發現在mRNA水平上，Crtacl的表達量在OIH大鼠DRG中有明顯的升高。

干涉DRG中的Crtacl表達，可能在一定程度抑制芬太尼誘導的痛覺過敏發生。然而目前關于Crtacl參與OIH以及其作用機制還沒有相關報道。本課題的研.究內容至少在DRG上一定程度上揭示了，Crtacl可能在OIH發生的過程中扮演了重要角色，未來的研究可以將Crtacl作為潛在的治療OIH的新靶點。