五味子油低共熔溶劑萃取抗氧化物的研究

鮑英杰，王 磊，饒桂維*

(1.浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015;2.杭州師范大學(xué) 錢江學(xué)院理工分院，浙江 杭州 310018)

五味子分為北五味子和南五味子，北五味子質(zhì)一般比南五味子優(yōu)良。北五味子呈不規(guī)則的球形或扁球形，直徑5～8 mm。表面紅色、紫紅色或暗紅色，皺縮，顯油潤，果肉柔軟，有的表面呈黑紅色或出現(xiàn)“白霜”。腎形，表面棕黃色，有光澤，種皮薄而脆。果肉氣微，味酸；種子破碎后，有香氣，味辛、微苦。北五味子主要產(chǎn)地為東北地區(qū)及內(nèi)蒙古、河北、山西等地。南五味子粒較小。表面棕紅色至暗棕色，干癟，皺縮，果肉常緊貼種子上[1]。五味子中含有五味子素及維生素C、樹脂、鞣質(zhì)及少量糖類。有斂肺止咳、滋補(bǔ)澀精、止瀉止汗之效。五味子中含有木脂素、多糖、皂苷和黃酮等多種成分[2-3]，并且具有很好的抗氧化作用。其葉、果實(shí)可提取芳香油。種仁含有脂肪油，榨油可作工業(yè)原料、潤滑油。莖皮纖維柔韌，可供繩索。低共熔溶劑是指由一定化學(xué)計(jì)量比的氫鍵受體體(如季銨鹽)和氫鍵供體(如羧酸、醇、胺類和糖類等)組合而成低共熔混合物，其凝固點(diǎn)顯著低于各個(gè)組分純物質(zhì)的熔點(diǎn)[4]。其制備簡單，成本低,無需復(fù)雜的純化,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于電化學(xué)、有機(jī)反應(yīng)和功能材料等領(lǐng)域。低共熔溶劑作為萃取劑廣泛結(jié)合各種萃取技術(shù)(超聲輔助萃取、微波輔助萃取、中空纖維萃取和固相萃取等)。在萃取中低共熔溶劑的優(yōu)勢(shì)主要依賴于以下四個(gè)方面：(1)凝固點(diǎn)與其組分組成和物質(zhì)的量比相關(guān)，(2)室溫下具有較高黏度，(3)一般密度比水大，能快速沉降實(shí)現(xiàn)兩項(xiàng)分離，(4)不同組分合成的低共熔溶劑具有不同極性，從而提高了對(duì)不同極性分析物的萃取效率。并且與傳統(tǒng)的甲醇萃取劑相比,低共熔溶劑具有原料易得、低毒性、可生物降解、對(duì)環(huán)境無污染、容易再生等優(yōu)點(diǎn)。這些特性決定了低共熔溶劑在中藥的有效成分萃取方面有著較高的研究價(jià)值。隨著低共熔試劑的不斷開發(fā)，有越來越多的研究利用低共熔溶劑分離生物體中的活性成分，包括類黃酮、兒茶素、酚酸、萜類化合物和皂苷。

本文主要以干制北五味子為研究對(duì)象，提取其油脂，探究不同種低共熔溶劑作為萃取劑與傳統(tǒng)甲醇萃取后產(chǎn)物的抗氧化性。從而得知各種低共熔溶劑與傳統(tǒng)甲醇萃取五味子油有效成分的能力對(duì)比并選出最優(yōu)組。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：五味子(干制)，產(chǎn)地為中國遼寧，研磨機(jī)研磨成粉狀，放置在陰涼干燥處待用。

試劑：氯化膽堿，乙二醇，乳酸，檸檬酸，尿素，葡萄糖，草酸，甲醇，乙醇，硫酸亞鐵，水楊酸，氫氧化鈉，磷酸，鐵氰化鉀，三氯乙酸，三氯化鐵，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，鄰苯三酚，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，鹽酸。以上皆為分析純。以及30%濃度過氧化氫。

設(shè)備：L6S紫外分光光度計(jì)，98-1-B型電子調(diào)溫電熱套，07HWS-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器，JK-100型超聲波清洗器，KQ5200DE型超聲波清洗機(jī)，C型30玻璃儀器快速烘干器，GL-20-G-Ⅱ型離心機(jī)，LG10-2.4A型離心機(jī)，RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,PL402-L型電子秤，ME204E型電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五味子油的提取

精確稱取20.00 g五味子粉末，放入圓底燒瓶中，以石油醚為提取溶劑，按照固液比1∶20(g∶mL)加入，保鮮膜封住瓶口避免石油醚揮發(fā)，在陰暗避光的環(huán)境下浸泡1 h。70 Hz超聲10 min。再加熱套加熱至微沸，回流，對(duì)五味子粉末提取3 h[5-7]。3 h后停止加熱，使石油醚緩慢降至室溫，再用布氏漏斗過濾，在過濾之前，保證布氏漏斗已清洗干凈，并要干燥完全，防止過濾時(shí)有水份混入，在下一步分離五味子油時(shí)，如果混合液中有水存在，五味子油和水極易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。過濾完成后取其澄清液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分離石油醚，得到淡黃色澄清油狀物，為五味子油。

1.2.2 DES的制備

用不同的氫供體來制備DES。按照比例，取兩組組分，加入圓底燒瓶中，水浴恒溫磁力攪拌，溫度保持在80℃，直至形成均勻穩(wěn)定的無色透明液體[8-9]。DES的保質(zhì)期較短，萃取五味子油的DES需當(dāng)天配制。對(duì)于氫鍵受體的選擇，采用市面上主流，最多被使用的氯化膽堿，而氫鍵供體的選擇，依照在實(shí)驗(yàn)和以后工業(yè)生產(chǎn)中，原料的成本易得性和安全可控的原則，選取乙二醇、乳酸、檸檬酸、尿素、葡萄糖、草酸六種。第一步實(shí)驗(yàn)中各DES組分的物質(zhì)的量比采用大多數(shù)實(shí)驗(yàn)和工業(yè)生產(chǎn)中的1∶2的比例。制備的DES成分配比及其名稱縮寫如表1所示。

表1 各實(shí)驗(yàn)組低共熔溶劑的構(gòu)成

1.2.3 DES萃取五味子油抗氧化物質(zhì)

將配好的DES于水浴鍋中60℃加熱，降低黏度。取5.0 mL離心管，加入1.0 mL五味子油，再加入2.0 mL相應(yīng)的DES。充分振蕩，超聲10 min，然后在60℃的水浴鍋中萃取1 h。萃取時(shí)，混合物每隔15 min取出振蕩半分鐘。一小時(shí)后將混合物在離心機(jī)中以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。離心結(jié)束，用注射器針頭扎破離心管，取出萃取物(下層相)[10]。

1.2.4 甲醇/水(80∶20)萃取五味子油萃取抗氧化物質(zhì)

取5.0 mL離心管，加入1.0 mL五味子油，隨后加入2.0 mL甲醇/水(80∶20)混合。充分振蕩后，超聲10 min，然后在60℃的水浴鍋中萃取1 h。在萃取時(shí)，混合物每隔15 min振蕩半分鐘。1 h后將混合物在離心機(jī)中以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。離心結(jié)束，用注射器取出萃取物(上層相)。

1.2.5 不同萃取劑萃取的物質(zhì)抗氧化性研究

1.2.5.1 各萃取物的全波段掃描

準(zhǔn)備十四只比色管,將DES-1至DES-6和甲醇/水(80∶20)總共七組萃取劑萃取五味子油所得的物質(zhì)各1.0 mL加入比色管中,甲醇稀釋至25.0 mL。再準(zhǔn)備DES-1至DES-6與甲醇/水(80∶20)總共七組萃取劑1.0 mL直接加入比色管中,甲醇稀釋至25.0 mL。以只加入萃取劑的組別為對(duì)照組，對(duì)其對(duì)應(yīng)萃取物進(jìn)行全波段掃描[11]。

1.2.5.2 各萃取物的過氧化氫清除率的測(cè)定

選擇一種萃取劑所萃取的物質(zhì)5.0 mL，平均分為五組，分別添加0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%過氧化氫溶液。過半小時(shí)體系反應(yīng)穩(wěn)定后，稀釋200倍，通過全波段掃描確定242 nm處為萃取物的最大吸收波長，在此波長下測(cè)定其總共五組吸光度[12]。分別測(cè)定DES-1至DES-6與甲醇/水(80∶20)總共七組萃取劑所萃取的物質(zhì)。

1.2.5.3 各萃取物羥基自由基的清除率

選擇一組萃取物，在反應(yīng)體系中依次加入9×10-3mol/L的FeSO4溶液1.0 mL，9×10-3mol/L的水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，以及1.0 mL萃取液，最后加入6×10-3mL/L的H2O21.0 mL，啟動(dòng)反應(yīng)，在37℃水浴環(huán)境中反應(yīng)0.5 h。最后在510 nm波長下測(cè)定樣品的吸光度。空白組以相同體積蒸餾水代替樣品溶液，按下式計(jì)算樣品對(duì)羥基自由基的清除率[13-15]，分別測(cè)定DES-1至DES-6與甲醇/水(80∶20)總共七組萃取劑所萃取的物質(zhì)。

式中∶Ao，空白對(duì)照液的吸光度；Ax，加入萃取液后的吸光度；Axo，不加H2O2時(shí)萃取液的本底吸光度。

1.2.5.4 各萃取物總還原力的測(cè)定

選擇一組萃取物，在試管中依次加入萃取液2.0 mL和0.2 mol/L，pH值= 6.6 磷酸緩沖液2.5 mL，1 %鐵氰化鉀2.5 mL，混勻，于50℃水浴反應(yīng)20 min，取出，立即用冰水水浴冷卻至室溫，再加入2.5 mL的10%三氯乙酸溶液，混合均勻后在離心機(jī)3000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，在離心管中吸取5.0 mL上清液，加入4.0 mL去離子水，1.0 mL的1 mg/mL三氯化鐵溶液，靜置10 min。蒸餾水作空白，700 nm測(cè)量吸光度，平行3次，取平均值。相同濃度下，吸光度值越大，表示樣品還原能力越強(qiáng)[16-18]。分別測(cè)定DES-1至DES-6與甲醇/水(80∶20)，總共七組萃取劑所萃取的物質(zhì)。

1.2.5.5 各萃取物的DPPH清除率

取0.0039 g DPPH加入100.0 mL無水乙醇。選擇一組1.0 mL萃取液加入4.0 mL DPPH(0.101 mmol/L)溶液中，搖勻避光靜置30 min，以甲醇對(duì)分光光度計(jì)調(diào)零，于517 nm波長下測(cè)定吸光值，定為 Ao，每組樣品平行測(cè)定3次[14,19-21]，分別測(cè)定DES-1至DES-6與甲醇/水(80∶20)總共七組萃取劑所萃取的物質(zhì)。

式中：Ao為空白對(duì)照吸光值，A為樣品吸光值

1.2.5.6 各萃取物的超氧陰離子清除率的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法，取5.0 mL 50 mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液(pH值=8)，置于25℃水浴中保溫20 min，加入2.0 mL萃取液，再加入1.0 mL 5mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻，25℃水浴中反應(yīng)5 min，最后加入1.0 mL 10 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，在320 nm處測(cè)定吸光度，對(duì)照組以超純水代替鄰苯三酚溶液，空白組以蒸餾水代替待測(cè)液[22]。

式中：A為樣品組吸光度；Ao為對(duì)照組吸光度;Aox為空白組吸光度

1.2.5.7 通過DPPH法比較同種類萃取劑的不同組分比對(duì)萃取效果影響的測(cè)定

用上述同種DPPH清除率方法，測(cè)量DES-1和DES-7至DES-10總共五組萃取劑所萃取的物質(zhì)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各萃取物的全波段掃描

通過圖1七種不同萃取物的全波段掃描圖可知，各圖的峰值在240～243 nm之間，平均值242 nm，此波長即可作為過氧化氫清除率測(cè)定的波長。各組最大的吸收峰值順序是乙二醇DES組最大，其次是甲醇組，草酸DES組，葡萄糖DES組，乳酸DES組，尿素DES組，檸檬酸DES組。乙二醇DES組萃取物最大的吸收峰值為2.723 Abs。

圖1 提取液全波長掃描

Fig.1 extract full wavelength scanning

2.2 不同萃取物的過氧化氫清除率

圖2 不同濃度過氧化氫對(duì)各萃取物溶液的影響

由圖2所示，隨著過氧化氫濃度的提高，各萃取物溶液的吸光度變化不明顯，說明其對(duì)于過氧化物的抗氧化性較好，并不能判斷各個(gè)萃取劑萃取能力的區(qū)別。

2.3 不同萃取物的羥基自由基清除率

圖3 不同萃取物的羥基自由基清除率比較

由圖3所示，各萃取物的羥基自由基清除率的能力中以乙二醇DES為萃取劑的萃取物最佳，高于以傳統(tǒng)甲醇/水(80∶20)為萃取劑，其余的DES萃取劑組均低于傳統(tǒng)甲醇/水(80∶20)萃取劑組。

2.4 不同萃取物的總還原力測(cè)定

圖4 不同萃取物的總還原力的比較

由圖4所示，各萃取物的總還原力中以乙二醇DES為萃取劑的萃取物最佳，高于以傳統(tǒng)甲醇/水(80∶20)為萃取劑，其余的DES萃取劑組均低于傳統(tǒng)甲醇/水(80∶20)萃取劑組。

2.5 不同萃取物的DPPH清除率

圖5 不同萃取物的DPPH清除率的比較

由圖5所示，各萃取物的DPPH清除率中以乙二醇DES為萃取劑的萃取物最佳，其次是乳酸DES組的萃取物，高于以傳統(tǒng)甲醇/水(80∶20)為萃取劑，其余的DES萃取劑組均低于傳統(tǒng)甲醇/水(80∶20)萃取劑組。

2.6 不同萃取物的超氧陰離子清除率測(cè)定

圖6 不同萃取物的超氧陰離子清除率的比較響

由圖6所示，各萃取物的超氧陰離子清除率以乙二醇DES為萃取劑的萃取物最佳，其次是乳酸DES組的萃取物，高于以傳統(tǒng)甲醇/水(80∶20)為萃取劑，其余的DES萃取劑組均低于傳統(tǒng)甲醇/水(80∶20)萃取劑組。

2.7 DPPH法比較同種類萃取劑的不同組分比對(duì)萃取效果影響

圖7 同種類萃取劑的不同組分比DPPH清除率比較

由圖7所示，不同組分的乙二醇DES所萃取五味子油的萃取物DPPH清除能力變化不大，說明DES中兩種組分的物質(zhì)的量比對(duì)其萃取能力影響較小。

3 結(jié)論

本實(shí)所萃取得的物質(zhì)均為淡黃色溶液。在不同種低共熔溶劑中，氫供體和氫受體的組成及比例決定了其物理化學(xué)性質(zhì)，影響了其對(duì)溶質(zhì)的溶解及萃取能力。對(duì)六種不同種類的DES溶劑和傳統(tǒng)甲醇/水(80∶20)所萃取的七種五味子油萃取物全波段掃描，最大吸收波長在240～243 nm之間，其中最大吸收峰值是乙二醇DES組的2.723 Abs。

在過氧化氫清除率的的實(shí)驗(yàn)中，過氧化氫濃度的變化對(duì)各物質(zhì)在242 nm的吸光度影響較小，可以理解為各物質(zhì)對(duì)于過氧化物的抗氧化性較好。在接下來羥基自由基清除率實(shí)驗(yàn) ，總還原力測(cè)定，DPPH清除率測(cè)量，超氧陰離子清除率測(cè)定中，乙二醇DES萃取的物質(zhì)均為最佳，說明其具有較好的抗氧化力，可證明乙二醇DES的萃取能力較好。可以在一些特定環(huán)境下替代甲醇萃取五味子油。并且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，研究中采用的低共熔溶劑和其對(duì)應(yīng)的五味子油萃取物具有不同的黏度，其中乙二醇DES和乳酸DES黏度較低，實(shí)驗(yàn)操作較為方便，而其余四種低共熔溶劑的黏度均較大，難以量取和使用，要在一定的溫度下保持其適中的黏度。也可說明乙二醇DES具有的較高萃取效率和較容易的操作條件，使之成為萃取五味子油有效成分的理想萃取劑。

最后比較不同組分物質(zhì)的量比的DES萃取能力，選擇萃取效果最好的乙二醇DES組，分別制備乙二醇與氯化膽堿五種不同物質(zhì)的量比組成的低共熔溶劑，通過其萃取物的DPPH清除率的能力測(cè)定，結(jié)果表明不同組分物質(zhì)的量比的DES萃取能力基本相同。證明低共熔溶劑中各組分的物質(zhì)的量比對(duì)其萃取能力的影響不大。氯化膽堿和乙二醇的物質(zhì)的量比為1∶2時(shí)，溶液密度大、黏度高，密度大可以提高溶質(zhì)的溶解能力但相反，黏度大不利于萃取過程中物質(zhì)的傳遞，隨著氯化膽堿與乙二醇的物質(zhì)的量比改變，之家乙二醇的比例，低共熔溶劑的密度減小同時(shí)黏度降低，這可能是導(dǎo)致不同低共熔溶劑萃取物抗氧化能力變化不大的原因。