大刺鰍致病性維氏氣單胞菌分離鑒定及藥物敏感性研究

林 煜，樊海平，陳 斌，薛凌展，鐘全福，張 坤，吳 斌

（1福建省淡水水產研究所，福州350002；2福建天馬科技股份集團有限公司，福州350308；3福建省水產技術推廣總站，福州350002）

0 引言

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中，部分菌株是微生態環境中正常存在的[1]，而另一些菌株具有致病性，廣泛感染水產養殖動物 ，如中華絨螯蟹[2、3]、黃喉擬水龜[4]、黃顙魚[5、6]、中華鱉[7]、青海湖裸鯉[8]、鯽[9-12]、鱘[13、14]、南方鲇[15]、烏鱧[16]、胭脂魚[17]、齊口裂腹魚[18]、金魚[19]、鰻鱺[20]、羅非魚[21、22]、中國大鯢[23]和框鏡鯉[24]等諸多淡水養殖動物，是水產養殖重要的致病菌之一。此外，維氏氣單胞菌對恒溫動物是一種機會致病菌，但有人認為免疫功能健全者也可被感染，患者發生急性腹瀉、菌血癥、腦膜炎和心內膜炎等。近年來，日益增多的病例表明維氏氣單胞菌已成為一種重要的人、魚共患致病菌，并在食品安全上表現出重要意義，部分國家已經將其規定為食品安全的檢疫對象[1、25]。

大刺鰍(Mastacembelus armatus)主要分布在中國長江以南各水系。近年來，濫捕和環境污染加重等因素，造成大刺鰍野生資源銳減，部分省份已將其列入重點保護的野生動物名錄[26-28]。福建省淡水水產研究所自2013年開始，持續開展人工繁育、苗種培育、病害防治、飼料營養和養成等技術研究，突破了人工繁育、規模化苗種培育、精養池和土池養殖等關鍵技術[29-35]。在近年冬季溫棚養殖過程中發現，為了維持水溫而減少換水量，易引起養殖水體氨氮和亞硝酸鹽升高，部分大刺鰍出現活力下降、游動緩慢、食欲減退或喪失的癥狀；隨著病情進一步發展，病魚體表局部皮膚特別是鰓蓋表面發炎后形成潰瘍，有時伴隨爛尾癥狀，解剖發現病鰍鰓絲潰爛，肝臟、腎臟和脾臟腫大并充血，部分病魚呈出血和腹水癥狀。此病從幼魚到成魚均發生，馴養的野生大刺鰍發病率高于人工繁育的子一代和子二代。由于發病后治愈期長，且易反復發病，嚴重的單口池累計死亡量可達30%。為了明確病原，筆者開展了病原的分離純化、致病性和致病菌株的藥物敏感性試驗，以期為該病科學防控提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病大刺鰍（體長8～22 cm，體質量2～54 g）和回歸感染用健康大刺鰍（體長18～22 cm，體質量45～54 g），均采自順昌縣兆興魚種養殖有限公司。營養瓊脂(Nutrient Agar)、腦心浸液培養基(Brain Heart Infusion Medium)、營養肉湯(Nutrient Broth)、水解酪蛋白瓊脂、革蘭氏染色液(Gram Stain Sets)均購自北京陸橋技術有限責任公司。藥敏紙片和細菌微量生化反應管購于杭州微生物試劑有限公司。TaqMix、DNA Marker DL2000 購自天根生化科技（北京）有限公司。細菌基因組 DNA 提取試劑盒、PCR 擴增細菌 16S rDNA 試劑盒、TaqDNA 聚合酶均購自上海生工生物工程技術有限公司。

1.2 病原菌的分離純化與保存

取病魚體表局部皮膚和鰓蓋表面具有潰瘍癥狀的病魚，實驗室無菌操作分別取肝、腎組織于營養瓊脂平板劃線分離細菌，28℃培養24 h后挑取形態大小、顏色等特征基本一致的優勢菌落重復純化2 次，獲得純培養后，接種腦心浸出液培養基，28℃培養16 h，加入培養基體積25%無菌甘油混勻后，先放置于-20℃冰箱2 h，后轉移到-80℃冰箱備用。

1.3 回歸感染試驗

取健康大刺鰍暫養于150 L玻璃缸中，連續曝氣，溫度控制在25～27℃，日投喂2次，正常排污投餌2次，每次30%，暫養7天穩定后，試驗前停食24 h后用于回歸感染試驗。

將-80℃保存菌株接種于營養瓊脂平板，28℃培養24 h，無菌生理鹽水清洗制成菌懸液，根據預試驗，采取無菌生理鹽水5 倍稀釋，麥氏比濁法測量細菌懸液濃度至 4.70×1010、9.40×109、1.88×109、3.75×108、7.5×107cfu/mL。隨機撈取健康大刺鰍，共分6 組，每組7尾，背部肌肉注射，試驗組每尾注射細菌懸液0.2 mL，對照組注射0.2 mL 無菌生理鹽水，暫養期間連續曝氣，不投餌，水溫26～28℃，每天換水1 次，每次換水30%。每日觀察記錄各組發病情況，及時撿除死亡大刺鰍，連續觀察14天，對瀕臨死亡、癥狀顯著的大刺鰍進行細菌的再次分離、純化和保種。并進行二次回歸感染、細菌分離、純化和保種。

1.4 菌株分類與鑒定

1.4.1 形態特征觀察 將分離純化得到的菌株接種于普通營養瓊脂平板上，28℃培養14～16 h，觀察菌落形態特征，挑取單菌落，革蘭氏染色，在Leica光學顯微鏡下觀察菌體形態特征。

1.4.2 生理生化特性測定 參照細菌微量生化反應管說明書及《伯杰細菌鑒定手冊》[36]具體方法對純化的細菌進行鑒定。

1.4.3 16S rDNA鑒定 將保存菌株接種于營養肉湯中，28℃，200 r/min振蕩培養18 h后，取菌液經12000 r/min離心10 min后收集菌體，DNA的提取參考天根細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書進行。上游物序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR 反 應 體 系50 μL，其中2×Premix Taq 25 μL(Takara)，上下游引物各2μL(10μmol/L)，DNA模板4μL，ddH2O 17μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，30 個循環；最后72℃延伸7 min。PCR 反應產物在120 V、1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳25 min后，用凝膠成像系統觀察電泳結果后送鉑尚生物技術（上海）有限公司測序，通過NCBI 中的nucleotide blast 進行序列同源性分析，并采用ClustalX 1.8 軟件進行序列比對，再通過MEGA 5.0 軟件構建系統發育樹。

1.5 藥物敏感性試驗

將首次分離保存菌株接種營養肉湯，28℃培養24 h后，調整菌液濃度至108cfu/mL。取100μL 調整后的細菌懸液，均勻涂布于水解酪蛋白瓊脂平板，適度干燥后用無菌鑷子將藥敏紙片貼于培養基表面，28℃培養24 h 后分別測量各種抗生素紙片抑菌圈的直徑，根據產品說明書判別結果。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離純化與培養

從自然發病、一次回歸感染和二次回歸感染病魚中共分離純化到3 株細菌，分別命名為MaG170114NA、MaG170808NA、MaG170827NA。

2.2 回歸感染

2次回歸感染發病魚主要癥狀表現基本一致。24 h，注射針孔周圍的組織微凸起且皮膚顏色發白，死亡的大刺鰍肝臟腫大、顏色暗紅；48 h，針孔周圍皮膚有出血現象，死亡大刺鰍肝臟腫大、顏色變淺呈粉色；3 天后，針孔處皮膚開始潰爛，形成開放性創口，死亡大刺鰍肝臟顏色呈土黃色，失血。個別死亡魚解剖腹腔積水。

人工歸回感染試驗結果表明，分離菌株MaG170114NA 的一次回歸濃度達1.88×109cfu/mL 3天產生死亡，濃度達9.4×109cfu/mL 1天產生死亡、3天死亡率100%。一次回歸感染分離菌株MaG170808NA的二次回歸感染濃度達1.85×108cfu/mL，24 h 產生死亡；濃度達9.24×108cfu/mL，24 h死亡率達100%，詳細結果見表1～2。

表1 分離菌株MaG170114NA的一次回歸感染試驗結果

2.3 病原菌的分類與鑒定

2.3.1 細菌的形態學特征 分離菌株在普通營養瓊脂平板上生長較快，菌落呈乳白色圓形，呈中央突起，表面光滑濕潤，直徑為2～3 mm，表面光滑，顏色灰白色。菌體革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓，短桿狀，菌體大小(0.5～0.6)μm×(0.8～1.0)μm，無芽胞。

表2 一次回歸感染分離菌MaG170808NA的二次回歸感染試驗結果

2.3.2 生理生化特性 分離菌株具有運動性，能在1%NaCl生長，不能在6%NaCl中生長，氧化酶、V-P反應、甲基紅、吲哚試驗、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶陽性，精氨酸雙水解、硫化氫產生、尿素水解、丙二酸鹽利用陰性，可利用葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、海藻糖等，不發酵棉子糖、鼠李糖、阿拉伯糖等，詳細結果見表3。參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》，分離菌株的主要生化特征與維氏氣單胞菌特性基本一致，初步鑒定分離菌株為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)。

2.3.3 16S rDNA 序列分析 PCR 擴增MaG170114NA菌株的16S rDNA 基因，獲得約為1500 bp左右的預期片段。PCR 擴增產物經測序及Blastn 在線比對分析，結果表明菌株MaG170114NA的16S rDNA與NCBI數據 庫 的Aeromonas veroniiB33（GeneBank 登 錄 號KU188295）和Aeromonas veroniiCT17（GeneBank 登錄號KM362731）的16S rDNA 基因序列同源性為100%。從構建的致病性菌株MaG170114NA 的系統發育樹（圖4）可知，該致病性菌株與維氏氣單胞菌歸屬在同一分支中，即與維氏氣單胞菌親緣關系較近，可將其鑒定為維氏氣單胞菌。

2.4 藥物敏感性

菌株MaG170114NA對所測試的24種抗菌藥物中的氨基糖苷類，β-內酰胺類中的頭孢噻肟、頭孢他啶以及大環內酯類藥物中的紅霉素高度敏感；對喹諾酮類的氧氟沙星、環丙沙星、依諾沙星及磺胺類的復方新諾明中度敏感；對β-內酰胺類的青霉素類藥物，喹諾酮類的諾氟沙星和恩諾沙星，大環內酯類的羅紅霉素，四環素類的四環素、多西環素，氯霉素類的氟苯尼考，糖肽類的萬古霉素，多粘菌素類的多粘菌素B等12種藥物耐藥，詳細結果見表5。

表3 分離菌株部分生理生化特征

3 結論

本研究對在人工養殖環境下發生的，主要癥狀表現為腹腔積液、腸道發炎、肛門紅腫、體表潰爛、爛尾、爛鰓等癥狀的大刺鰍進行了跟蹤調查。對具典型癥狀的病魚的肝、腎等組織分離純化得到優勢菌株MaG170114NA。人工回歸感染證實原始分離菌株MaG170114NA 為該患病大刺鰍致病菌。對菌株MaG170114NA進行形態特征、生理生化特性測定，并結合16S rDNA 序列分析和系統發育樹構建，鑒定MaG170114NA 菌株為維氏氣單胞菌。采用藥敏紙片擴散法測定菌株MaG170114NA 的藥物敏感性，該菌株對頭孢他啶、慶大霉素、紅霉素等8 種藥物高度敏感；對氧氟沙星、環丙沙星、依諾沙星及復方新諾明4種藥物中度敏感；對氟苯尼考、恩諾沙星多粘菌素B等12種表現耐藥。

圖4 MaG170114Na菌株的系統發育樹

表5 分離菌株MaG170114NA藥敏試驗結果

4 討論

維氏氣單胞菌是一種人、獸、魚共患病原菌，廣泛存在于水體及土壤之中，是動物腸道和自然生態系統的正常菌群之一[1]。作為條件致病菌，有些菌株具有很強的毒力，對水產經濟動物具有很強的致病性，可引起黑魚、錦鯉、框鏡鯉、西伯利亞鱘、異育銀鯽、草魚、鰻鱺、黃顙魚、斑點叉尾鲴、胭脂魚、中華鱉、中華絨螯蟹等大多水產動物大量發病死亡[37-40]，但維氏氣單胞菌引起養殖大刺鰍發病并產生死亡為首次報道。

維氏氣單胞菌感染水生動物后的主要癥狀以鰭基出血、腹腔積液、肛門紅腫外凸等為主要特征[2-25]，如中華鱘感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為鰭基具出血點，鰓絲暗紅，腹部膨脹、泄殖孔腫脹，腹腔積血色液體，腸道充血[13]；齊口裂腹魚感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為鰭基充血，頭部鰓蓋等充血，肛門紅腫，腹腔積水，腸道發炎[18]；中國大鯢體表粘液脫落，皮膚出現白斑，四肢潰爛，露出紅色肌肉，胃、腸道內壁有出血點[23]；胭脂魚感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為眼球充血，腹部有明顯出血點，體表少量鱗片脫落，肛門紅腫，并有大量黏液流出[17]；烏鱧感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為體表有大量出血點，鰭條充血，肛門紅腫，腸道充血[16]；暗紋東方鲀感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為鰭基部充血、肛門紅腫、腹部膨脹、腹腔內積血色液體[14]；美國鰣魚感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為鰭條充血、鰓部顏色鮮紅、肛門紅腫、腹腔有血水、腸道內無食物充滿黏液[41]。與本研究結果對比顯示，維氏氣單胞菌感染大刺鰍主要癥狀與大多水生動物癥狀相似，主要表現為腹腔積液、腸道發炎、肛門紅腫，肝臟、腎臟和脾臟腫大并充血，但大刺鰍還同時表現體表局部發炎后形成潰爛病灶的典型癥狀，有時伴隨爛尾、爛鰓癥狀，這可能是大刺鰍具有群體棲息習性，體背部棘相互刺傷，導致維氏氣單胞菌病原菌在傷口處大量繁殖，最終表現出體表潰爛癥狀及爛尾癥狀。這與筆者在回歸試驗中，試驗魚注射部位表現出來的潰爛等癥相似。

不同地域、不同季節、不同宿主甚至同一養殖場隨不同養殖季節分離菌株的藥物敏感性存在差異。本試驗對分離菌株的藥敏結果顯示，對頭孢噻肟、頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素等敏感，而對羅紅霉素、四環素、多西環素、氟苯尼考、諾氟沙星具有較強的耐藥性。這與之前報道的中華絨螯蟹、黃顙魚、鰻鱺、胭脂魚、中華鱉等水產動物分離的維氏氣單胞菌的藥敏試驗結果有差異。耿昕穎等對52株不同淡水魚類維氏氣單胞菌耐藥表型的分析認為，52株維氏氣單胞菌存在比較嚴重的耐藥性，且不同地域分離的維氏氣單胞菌菌株對常用的抗菌藥物的MIC結果存在明顯差異[42]；汪開毓等[43]的研究認為，不同地區分離的維氏氣單胞菌具有地域性差異，而同一地區分離株既存在相同基因型現象，也存在基因型多樣性現象。本研究根據藥物敏感試驗結果，選擇合適的藥物在大刺鰍維氏氣單胞菌病暴發期進行了臨床治療，取得了良好治療效果。因此，不同地域、宿主、季節細菌性疾病的防治，應對病原進行藥物敏感性試驗，選擇敏感藥物，精準、科學用藥，及時控制病情。

本研究對大刺鰍維氏氣單胞菌病的治療過程發現該病具有治愈期長且易反復發病的特點。這與維氏氣單胞菌作為條件致病菌，廣泛存在于水體及土壤之中[1]的特點相關。因此對該病應以預防為主：保持養殖水體的清潔，避免維氏氣單胞菌病大量繁殖；做好大刺鰍的健康養殖，避免過密養殖造成體背部棘相互刺傷而感染病源菌等因素的發生。這樣才可以盡量避免該病的發生。