國外引進辣椒遺傳多樣性的ISSR研究

徐小萬，夏碧波,，宮 超，王恒明，李 穎，吳智明

（1廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣州510640；2仲愷農業工程學院園藝園林學院，廣州510225）

0 引言

辣椒(Capsicumspp.)在蔬菜作物中地位頗高，享譽國際，不僅具有世界性的種植范圍，也受到全球消費者的喜愛，可謂家庭必備[1]。辣椒屬于茄科(Solanaceae)茄亞族(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)一年生或多年生植物，灌木、半灌木，多分枝。辣椒屬大約有25個種，國際植物遺傳資源委員會確定其中5個為栽培種，它們是C.annuum、C.frutescens、C.chinense、C.baccatum、C.pubescens[2]。辣椒主要分布在南美洲，栽培種世界各地均有分布。

世界各國非常重視辣椒育種研究，常規育種已經取得了巨大成就，選育了一大批優良品種應用于生產，產生了較好的經濟效益和社會效益。世界各辣椒育種團隊對辣椒種質資源開展了大量研究，這些研究成果對辣椒育種和產量的提高起到很重要的作用。盡管各辣椒科研團隊收集引進或創制了較豐富的辣椒種質資源，但是大部分研究工作都停留在辣椒種質資源形態描述階段[3-4]。分子標記是繼形態標記、細胞學標記和生化標記之后，近20 年來，廣泛應用的一種新的標記方法。與以往的遺傳標記相比，分子標記有許多特殊的優點，如無表型效益、不受環境限制和影響等。分子標記已廣泛用于種質資源遺傳多樣性研究。

利用分子標記技術開展了部分辣椒種質資源分析研究工作，如基于DNA 分子雜交的分子標記RFLP[5]，基于 PCR 反應的分子標記 RAPD[6-11]、SSR[12-13]、ISSR[14-17]、SRAP[12-13,18]，基于 PCR 與限制性酶切結合的檢測方法AFLP[19]。上述利用分子標記分析辣椒種質資源相關研究取得了較好成效，但辣椒種質資源遺傳多樣性分析相對滯后于辣椒種質資源的開發與利用。

國外辣椒種質與國內資源親緣關系相對較遠，遺傳差異也較大，國外種質資源引進可拓展中國辣椒遺傳背景，增加資源儲備，為保證國內辣椒育種及產業發展奠定物質基礎。筆者以國外引進的30 份辣椒種質為試材[20]，采用ISSR 分子標記進行種質的聚類分析，為準確鑒定辣椒種質和科學利用辣椒材料提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

30份辣椒種質資源均引自馬來西亞，其中編號為156、159、162、163、168、181、182 和198 的8 份材料田間表現抗疫病和青枯病。

1.2 辣椒基因組DNA的提取

參照CTAB法提取30份辣椒材料基因組DNA[17]，試驗所用的緩沖液、dNTP 和Taq DNA 聚合酶均購自上海Sangon公司。

1.3 ISSR引物和擴增反應體系

根據SSR 序列特點設計的一套固定的ISSR 引物。本研究采用的是加拿大哥倫比亞大學(University of British Columbia Biotechnology, UBC)公布的ISSR引物，共計96條。從預備試驗中篩選出8條引物，這8條引物能擴增出清晰，重復性、穩定性及多態性均較好的PCR 產物。ISSR-PCR 反應體系參照徐小萬等[17]的方法。

1.4 數據統計與處理

選擇性擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，利用ABI377測序儀保存電泳膠圖。利用GENESCAN軟件分析保存的膠圖，每2個堿基讀一次數，Marker片段范圍為50～1000 bp，共讀取475 個數。一個泳道為一個樣品，每個泳道加入的熒光分子量標準ROX-1000，50～1000 bp 共23 條帶。利用膠圖中保存的圖像信號直接生成分子量矩陣(Matrix)，而后采用BINTHERE軟件把生成的分子量矩陣轉變為“0”、“1”二維矩陣，無帶記為“0”，有帶記為“1”[21]。

用NTSYSpc-2.10e軟件進行數據分析。聚類圖參照下列步驟進行：對原始矩陣用SimQual程序求DICE相似系數矩陣，并獲得相似系數矩陣，用SHAN程序中的UPGMA 方法進行聚類分析，并通過Tree plot 模塊生成聚類圖。主坐標二維圖或三維圖按照下列步驟進行：利用Qualitative Data程序生成30份國外引進辣椒種質的遺傳相似性系數矩陣，接著生成Dim center 數據矩陣，而后采用Eigen 程序，最后在Mtrix plot 和Mod3D plot選項中生成主坐標二維圖和三維圖。

2 結果與分析

2.1 DNA提取與ISSR引物分析

采用改良的CTAB法提取辣椒葉片DNA，經凝膠電泳檢測，各DNA 帶型均整齊一致，基本無降解現象。將 30 個樣的 DNA 濃度均調整到 40 ng/μL 進行ISSR-PCR反應擴增。從96個ISSR引物中篩選出的8個引物，在30 個辣椒樣品中共產生1781 條帶（表1），多樣性條帶共計1389 條，多樣性位點百分率77.99%。上述分析說明，試驗檢測的樣品具有較高的遺傳多樣性。8 條ISSR 引物的平均多元率(multiplex ration)為222條帶/引物，多樣帶多元率為173條帶/引物。

8 條ISSR 引物在30 個辣椒樣品中擴增片段的大小主要在200～650 bp 之間。但不同的引物能擴增出來的條帶數也是不同的，其中引物編號835和886擴增出的條帶數較多，分別為263 和250 條；而引物編號807 和840 擴增出的條帶數較少，分別為148 和157條。從表1 分析可知，8 條引物在30 份試驗樣品間擴增出來的條帶的多態率也是不同的，引物編號807 的條帶多態率最高為86.54%，而引物編號835 和886 引物的多態率較低，分別為73.00%和72.40%。由此可見辣椒種質資源存在極為豐富的遺傳多樣性，利用分子標記可以檢測辣椒種質間的親緣關系。

圖1 為引物編號807 和808 分別在編號為156、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167、168、169、171、172、173、174、175、177、178、180、181、182、183、184、190、191、192、198和199的30個辣椒材料中的ISSR-PCR擴增電泳圖譜。

表1 30份辣椒資源8條ISSR引物PCR擴增位點的多樣性

2.2 聚類分析

圖2 表明，30 個國外引進的辣椒資源的遺傳相似性系數在0.70～0.87 之間。從UPGMA 法聚類分析圖可知（圖2），遺傳相似性系數在約0.724(L1)時，30份國外引進的辣椒材料分為3個大類。第1類是最大的一個類群，共19 份辣椒材料，編號分別是156、159、163、168、178、174、183、184、181、182、190、180、192、198、199、162、173、158 和 191；第 2 類共 10 份辣椒種質資源，編號分別是157、165、169、171、172、164、160、166、177 和175；第3 類只有編號為167 的辣椒資源。若以遺傳相似性系數0.771(L2)為界，這30份國外引進的辣椒種質可分為4亞類。第Ⅰ亞類共18份辣椒材料，編號分別為156、159、163、168、178、174、183、184、181、182、190、180、192、198、199、162、173和158；第Ⅱ亞類只有編號為191 的辣椒種質；第Ⅲ亞類編號分別是157、165、169、171、172、164、160、166、177和175；第Ⅳ亞類只有編號為167的辣椒資源。

2.3 辣椒種質資源親緣關系的主坐標分析

對30份國外引進的辣椒種質資源的ISSR標記的原始矩陣進行主坐標分析；30份國外引進的辣椒材料的主坐標二維圖和三維圖具體如圖3～4。

30 份國外引進的辣椒材料在主坐標二維圖排序中分為4 類（圖3）。第Ⅰ類共18 份辣椒材料，編號分別為156、158、163、159、198、168、190、199、182、178、174、158、192、181、183、173、162、184和180；第Ⅱ類只有編號為191 的辣椒種質；第Ⅲ類編號分別是157、165、169、171、172、164、160、166、177和175；第Ⅳ亞類只有編號為167的辣椒資源。

圖1 引物807和808在30個辣椒材料中的ISSR-PCR擴增電泳圖譜

圖2 30個辣椒材料的ISSR聚類分析圖

圖3 30個辣椒材料的ISSR標記的主坐標二維散點圖

圖4 30個辣椒材料的ISSR標記的主坐標三維散點圖

30 份國外引進辣椒種質資源在主坐標三維圖排序中分為3 類。第1 大類共18 份辣椒材料，編號分別為 156、158、163、159、198、168、190、199、182、178、174、158、192、181、183、173、162、184和180，這與二維圖分類一致；第2 大類共11 份辣椒材料，編號分別是157、165、169、171、172、164、160、166、177、175和167；第3大類只有編號為191的辣椒種質資源。

通過對圖2～4 的結果比較分析可知，主坐標分析對30個國外引進的辣椒種質資源進行聚類和UPMGA系統聚類結果大體一致，部分材料略有差異；主坐標分析能直觀、多層次和整體地反映出辣椒種質資源的親緣關系。

3 討論

3.1 ISSR研究辣椒的遺傳多樣性

本研究從哥倫比亞大學公布的96條ISSR引物中篩選到8 條穩定性好的多樣性引物，這8 條ISSR 引物平均擴增條帶數為222條，平均多態條帶數為173條。已有研究者們應用ISSR 標記開展辣椒種質遺傳多樣性分析，均取得了較好的成效[14-17,22-24]。學者們對辣椒種質資源的遺傳多樣性已有大量研究[13]，對國外引進的辣椒種質資源的遺傳多樣性研究卻相對比較少[25]。筆者應用8 條ISSR 標記對30 份國外引進的辣椒種質資源進行了遺傳多樣性分析，從構建的遺傳相似系數和UPGMA聚類圖及主坐標分析可知，ISSR標記基本上可以把30份國外引進的辣椒種質分為2個大類，其中編號分別為156、158、163、159、198、168、190、199、182、178、174、158、192、181、183、173、162、184 和180這18 份材料為一個大類，為一年生辣椒(C.annuum)；另外的12份材料為另一個大類，可能包括其他的辣椒栽培種。由上述分析可知，ISSR分子標記在研究辣椒種質資源鑒定分類方面是一種可行的分子標記。

3.2 形態指標與ISSR標記聚類分析的比較

通過對比形態學性狀[20]和ISSR分子標記2種聚類結果分析可知，形態學標記與ISSR標記的聚類結果絕大部分相符，基本上能把一年生辣椒聚為一類，而其他的栽培種聚為另一類，由此說明形態學聚類與ISSR分子標記聚類具有一定的一致性。但在形態學性狀聚類分析時，編號為191的辣椒種質資源歸為中華辣椒(C.chinense)，而在利用ISSR 分子標記聚類分析時，編號為191 的辣椒種質資源卻歸為一年生辣椒(C.annuum)，這可能是本研究選用的ISSR引物太少，下一步需加大ISSR引物數量。2種方法從不同的水平和角度進行聚類，不能相互替換，只能互相結合和互相印證，以更全面闡明分析結果，更好分析辣椒種質資源的親緣關系。