脂肪干細胞在皮膚抗衰老方面的研究進展

潘盛盛 姜篤銀

[摘要]脂肪干細胞具有多向分化能力和豐富的旁分泌功能，且因為其來源廣泛、取材方便及組織損傷小等優點已成為細胞治療和組織工程應用的理想工具。而面部年輕化一直是整形美容領域的熱點，其中皮膚抗衰老又是重中之重，脂肪干細胞在皮膚抗衰老方面的作用吸引廣大學者研究探討。本文從離體實驗、在體實驗及臨床應用三個方面綜述脂肪干細胞在皮膚抗衰老方面的研究進展，以確定下一步研究的方向，為臨床治療提供更多可靠的依據。

[關鍵詞]脂肪干細胞;皮膚抗衰老;光老化;自然老化;干細胞臨床應用

[中圖分類號]R339.3+8 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2019）11-0158-05

Abstract： Adipose-derived stem cells have multi-directional differentiation ability and rich paracrine function， and have become an ideal tool for cell therapy and tissue engineering because of their wide sources， convenient materials， and small tissue damage. The application of facial rejuvenation has always been a hot spot in the field of plastic surgery. Among them， skin anti-aging is the most important thing. The role of adipose-derived stem cells in skin anti-aging has attracted researchers to study. In this paper， the research progress of adipose-derived stem cells in skin anti-aging is reviewed from three aspects： in vitro experiment， in vivo experiment and clinical application， to determine the direction of further research and provide more reliable basis for clinical treatment.

Key words： adipose-derived stem cells; skin anti-aging; photo aging; natural aging; stem cell clinical application

自2001年Zuk等[1]首次從脂肪組織中分離、提取出脂肪干細胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）并命名以來，ADSCs因來源廣泛、取材方便、組織損傷小、擴增迅速等優點已成為細胞治療和組織工程應用的理想工具。在組織損傷修復、抗衰老及組織工程等方面均可發揮顯著的作用。十多年來，ADSCs一直是干細胞研究領域的熱點，其抗衰老方面的作用更是吸引研究者的目光，本文就ADSCs在皮膚抗衰老方面的研究和應用進展進行綜述，討論目前的研究現狀、存在的問題以及未來研究可能的方向。

1 ?皮膚衰老的生物學特征

皮膚衰老是人整體衰老的一部分，身上各部位皮膚的衰老是不同步的，不同位置的皮膚首先本身厚度和性質不一樣，其次長年累月受到的刺激也不一樣，導致不同部位皮膚衰老的速度也會不一樣。而面部皮膚因為比較薄且長期暴露在外，受到紫外線等因素的影響更多，往往是最容易衰老的部位。皮膚的表皮層、真皮層以及皮膚附屬器的細胞和組織均會隨著機體年齡的增長而發生相應改變，但最具有特征性的還是真皮層成分的變化。真皮層中富含膠原纖維、網狀纖維、彈性纖維以及氨基多糖和蛋白多糖等基質，其中以膠原纖維的含量最為豐富，皮膚老化過程中，膠原纖維含量逐漸降低，真皮層厚度變薄，彈性纖維變性、減少，失去彈性、張力，從而導致皮膚衰老的一系列外在表現發生[2-3]，而真皮層成分變化的內因主要是成纖維細胞的衰老。

隨著年齡的增長以及環境的侵害，在多種內源性（年齡、遺傳、內分泌以及身心因素等）及外源性（物理化學刺激，主要是紫外線照射）因素的綜合影響下，皮膚發生老化，而其中紫外線的影響又稱光老化，在其中占據了極其重要的作用。紫外線致皮膚光老化的機制如下：①促進細胞凋亡：紫外線照射后皮膚細胞膜和細胞內部均會產生大量的活性氧（ROS），產生氧化壓力，導致細胞凋亡，引起皮膚衰老;②損傷DNA：紫外線通過其誘發的ROS使DNA在相鄰嘧啶堿基處產生環丁烷胞嘧啶二聚體和6-4光產物，這些突變與皮膚光老化形成皺紋有關;③降解膠原蛋白：紫外線照射皮膚后會誘導各種細胞表達相關的細胞炎性因子，其中表達量最高的是白細胞介素-1和腫瘤壞死因子α，這些細胞炎性因子主要通過激活細胞核因子кB（NF-кB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等影響皮膚細胞膠原蛋白的合成;④抑制膠原蛋白的表達：被紫外線上調的異二聚體AP-1可通過轉化生長因子-β/S mad信號通路下調膠原蛋白的表達，抑制膠原蛋白的合成;⑤染色體端?？s短：紫外線照射皮膚產生大量ROS，機體無法清除部分的ROS會不斷將三聯鳥嘌呤氧化生成8-氧-7，8二羥基-2-脫氧鳥苷酸，從而縮短端粒的長度，導致皮膚細胞的老化[4]。

2 ?ADSCs的生物學特性

真空負壓抽脂等技術可獲得脂肪組織，脂肪組織進行組織破碎剔除纖維經胰酶消化后分離并在體外培養脂肪干細胞，進而采用流式細胞儀根據ADSCs細胞表面標志物分選、鑒定獲得脂肪干細胞。目前研究結果表明，ADSCs并沒有特異的標志物，脂肪干細胞大多位于血管周圍區域。ADSCs形態類似成纖維細胞，抗原的表達與骨髓MSCs相似：CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD54、CD71、CD49、CD90、CD105、CD117。脂肪干細胞不表達造血標志物，如CD14、CD16、CD45、CD56、CD61、CD62、CD104、CD106，也不表達內皮細胞標志物CD31、CD144[5-6]。脂肪干細胞ADSCs和間充質干細胞MSCs免疫原性均較低，由于ADSCs 表達CD49d，而MSCs不表達CD49d，有學者用CD49d來區分ADSCs和MSCs。

ADSCs的生物學功能包括以下兩個方面：①多向分化潛能：ADSCs具有向多種成體細胞分化的能力，如：脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞（包括骨骼肌、平滑肌以及心肌細胞）等[1];②具有旁分泌功能：ADSCs 可合成分泌多種類型細胞因子和成分，包括：①生長因子：有表皮生長因子（EGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）、胰島素樣生長因子（IGF）等[7-9];②炎性相關因子：有干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL-1、IL-8、IL-9 等）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等[10-12];③細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）等亞細胞顆粒：EVs 包含有來源于母細胞的RNA、DNA、蛋白質、脂質以及完整的細胞器等[13]。以上兩個方面的生物學功能使得ADSCs能夠增強細胞增殖的活力，提高受損細胞生命力，拮抗細胞凋亡，具有促進血管生成、組織修復的能力，還可以抑制組織炎癥反應，在抗衰老等領域作用巨大。但具體機制復雜，作用機制方面仍未有明確的研究結果。

3 ?ADSCs的抗衰老實驗

3.1 離體實驗：ADSCs在細胞水平上具有改善衰老的人成纖維細胞各項功能的作用，能起到細胞水平的年輕化。Song SY[14]等讓ADSCs與人老化成纖維細胞（human dermal fibroblast，HDF）通過trans well小室共培養，在兩類細胞沒有直接接觸的情況下，ADSCs通過旁分泌功能誘導光老化HDF，使其Ⅰ型膠原蛋白生成增加，并降低其MMP-1的產生和p16的表達，這說明ADSCs的旁分泌作用可能是其發揮生物學效應的重要手段，甚至是主要手段。該實驗證明了ADSCs的旁分泌作用可以增加成纖維細胞膠原蛋白的合成，所以ADSCs在皮膚年輕化治療中存在較大潛能。

除了細胞共培養之外，脂肪干細胞條件培養基（ADSCs-CM）也可以用來作用于成纖維細胞，可以改善人真皮成纖維細胞增殖活性，并且可以恢復UVB照射后HDF的功能，抵消UVB照射對成纖維細胞增殖的影響[15]。此外，ADSCs-CM預處理可以減少UVB誘導的細胞凋亡和衰老，但對內源性衰老因子誘導的細胞衰老沒有明顯影響。說明ADSCs-CM具有細胞水平抗衰老的作用，這也補充說明了ADSCs旁分泌功能在抗衰老方面的重要性。

除了間充質干細胞的旁分泌功能外，最近幾年研究較多的是干細胞的外泌體在抗衰老中占有重要作用。Oh M[16]實驗表明，人誘導多能干細胞（human-iPSC）來源的外泌體能顯著降低衰老人成纖維細胞的SA-β-Gal和MMP-1/3的表達水平，并且可以使衰老HDF中的Ⅰ型膠原蛋白表達增加，提示干細胞來源的外泌體在皮膚衰老的治療方面有一定的前景。Choi JS等[30]提取了人脂肪干細胞來源的細胞外囊泡（HASC-EVs），實驗證實HASC-EVs能夠顯著抑制UVB照射誘導人成纖維細胞的MMP-1、-2、-3和-9的過表達，并增強了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型膠原的表達，從而達到皮膚抗衰老的目的。

3.2 動物實驗：在動物實驗方面，許多研究肯定了ADSCs對皮膚衰老的改善作用。Kim WS等[17]通過紫外線照射無毛小鼠背部皮膚造成皮膚光老化模型，并證明通過ADSCs的皮下注射可以增加老化皮膚的厚度和膠原蛋白含量，另外，UVB照射可以抑制HDF的增殖，而ADSCs-CM預處理的HDF可以逆轉這一效果，說明ADSCs及其分泌的細胞因子的抗皺效果主要是通過減少UVB誘導的細胞凋亡和刺激HDF的膠原合成來實現的。Kim JH[18]通過在48周齡的老年雌性無毛小鼠皮下注射ADSCs，觀察到皮膚膠原合成顯著增加，并且皮膚厚度、膠原密度和成纖維細胞數量也增加。此外，前膠原Ⅰ型蛋白和mRNA表達增加，這導致真皮膠原密度增加，通過CD31和NG2免疫熒光染色觀察到ADSCs皮下注射后的皮膚中血管生成增加。表明ADSCs皮下注射治療可能有改善老化皮膚的作用，其作用主要通過刺激真皮成纖維細胞的膠原合成和增加血管生成來發揮作用。這一韓國團隊在2019年又對實驗做了擴展，他們在50周老齡裸鼠背部皮下分別注射脂肪組織、ADSCs和以上兩種成分的混合物，結果三組實驗都有陽性結果，且混合組的膠原增生明顯超過脂肪組織和ADSCs單用組，皮膚厚度改善效果也最佳，可能與兩種組織混合后干細胞總量增加有關，也從側面反映ADSCs的抗衰老作用在一定范圍內與干細胞數量呈正比[19]。

Chang H[20]的研究結果表明，ADSCs分泌了某種生長因子抑制了酪氨酸酶的活性，從而抑制黑色素形成，在體內實驗中，ADSCs皮下注射可抑制UVB誘導的小鼠皮膚黑色素形成，說明ADSCs有一定的皮膚美白效果，但具體機制及安全性有待進一步研究。Jeong JH等[21]采用UVB照射誘導形成裸鼠光老化皮膚（模型），分別皮下注射人源ADSCs和成纖維細胞，實驗結果顯示兩者都可以顯著改善皮膚皺紋，ADSCs可以刺激膠原蛋白表達并降低基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，而成纖維細胞的注射對于膠原蛋白增加效果更佳明顯，但它同時也增加了MMPs表達，所以ADSCs在紫外線誘導的光老化皮膚抗衰老方面效果明確。Xu Y[22]在文章中提到ADSCs-CM明顯減輕了紫外線誘導光老化裸鼠皮膚的細胞抑制，并延緩了紫外線B（UVB）誘導的HDFs的衰老狀態。用ADSC-CM處理的HDF表現出更高的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白分泌，并顯著降低了MMP-1和MMP-3的分泌。TGF-β1中和抗體可部分降低恢復效果。研究結果表明，ADSCs對老化皮膚有改善作用，它們的作用主要是由于分泌因子，特別是TGF-β1，它刺激膠原蛋白的合成，減輕HDF中的膠原蛋白降解。Xu P等[23]使用紫外線B（UVB）輻射在BALB/c裸鼠上產生光老化皮膚模型，然后采用ADSCs和納米脂肪（Nanofat）皮下注射治療光老化皮膚，與對照組相比，ADSCs和Nanofat組增加了光老化皮膚的真皮厚度和新生血管形成，證實了脂肪干細胞在抗皮膚老化方面的作用。Gong MH[24]指出皮膚光老化主要是由皮膚干細胞的功能損耗引起的，皮膚干細胞生態位在維持干細胞存活和行為方面發揮著重要作用，他的團隊假設UVB輻射通過改變皮膚干細胞壁生態位誘導皮膚光老化，并且轉移的脂肪來源的干細胞（ADSCs）可以通過影響BMP信號傳導途徑和轉分化為皮膚干細胞來改造生態位。皮膚干細胞標志物，如p63，整合素α6和CD34，在ADSCs中共表達，這表明ADSCs可以轉分化為皮膚干細胞。實驗發現UVB照射通過改變皮膚干細胞生態位導致典型的光老化跡象，并且Bmp4是毛囊干細胞中BMP信號傳導的關鍵因素，ADSCs通過BMP4途徑調節和轉分化進入皮膚干細胞，重塑皮膚干細胞生態位，從而逆轉了這些典型的光老化跡象。

以上較多的動物實驗大多采用了脂肪干細胞皮下注射的實驗方法，老化皮膚模型有自然衰老的老年小鼠，也有紫外線誘導的皮膚老化動物模型，主要的實驗結果是觀察皮膚膠原蛋白合成分泌的變化，皮膚厚度的變化，MMPs的表達變化，還有皮膚黑色素形成的變化，膠原蛋白分泌合成增加使得皮膚厚度增加，皺紋減少從而達到皮膚的年輕化，而黑色素形成減少則是達到皮膚美白的年輕化效果。有人研究表明，ADSCs起作用是因為恢復了皮膚干細胞生態位，從而逆轉光老化的影響，但具體的作用機制和信號通路研究較少，是未來研究的方向，想要真正安全的臨床應用，必須搞清楚具體的作用機制才行。

4 ?臨床應用

雖然脂肪干細胞在皮膚抗衰老方面的機制并沒有研究清楚，對于干細胞治療的安全性、遠期并發癥等問題均沒有確切的答案，但是對于美麗的追求讓很多醫生和就醫者已經大膽地將脂肪干細胞用在了臨床皮膚抗衰老的治療上。Tonnard P[25]在臨床上采用納米脂肪（Nanofat）治療67例面部皮膚老化的病例，用于改善眼周淺表皮膚皺紋、下瞼的黑眼圈等問題，臨床應用顯示術后6個月患者皮膚質量有顯著改善，且未見明顯并發癥，提示納米脂注射可能成為皮膚抗衰老的一個重要治療方法。

自體脂肪填充用于治療面部軟組織的缺損或不足已在臨床開展很長時間，Bernardini FP[26]在臨床上回顧了98例面部脂肪填充的患者，平均隨訪時間為6個月，通過大腿及腹部的抽脂獲取富含活脂肪細胞和脂肪干細胞的脂肪顆粒，面部脂肪填充可有效矯正與年齡相關的脂肪萎縮，并且可以減少面部皺紋，改善皮膚質量，這說明在補充容量不足的同時，因為ADSCs的存在，自體脂肪組織的填充同時也起到了皮膚年輕化的作用。

各種脂肪組織來源的衍生物都含有ADSCs，包括本文之前提到的納米脂肪，還有膠原酶處理后得到血管基質片段（stromal vascular fraction，SVF），還有體外培養分離提純的ADSCs溶液，Charles-de-Sá L等[27]通過抽脂獲得就醫者脂肪組織，將部分脂肪組織體外處理獲得SVF，另一部分脂肪組織體外消化培養獲得脂肪間充質干細胞（ADSCs），并且擴增ADSCs至一定數量。將以上三種成分（脂肪組織顆粒、SVF、ADSCs）注射到患者皮下，隨訪結果表明，用脂肪組織顆粒、SVF或ADSCs治療得到了類似的效果，即治療效果沒有顯著差異，治療效果是增加了真皮的厚度，減少皮膚皺紋，改善了膚質。但是對于此類治療在臨床上是否允許和恰當，大部分國家臨床上都沒有明確的明文規定，體外擴增過的細胞直接用于人體在安全性方面是否應更加慎重。Gennai A[28]在臨床上通過微小孔徑抽脂針（0.8mm、0.5mm、0.3mm）獲得自體脂肪組織細小顆粒，分離提純后用于口周及眼周皮下注射，治療患者65例，改善皮膚老化療效顯著，主要表現也是口周、眼周皮膚細小皺紋的顯著減少和膚質的改善，未見明顯并發癥。Liang ZJ等[29]比較了103例接受納米脂肪（nanofat）和富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）真皮內注射（治療組）的面部皮膚老化患者和128例接受透明質酸（HA）注射治療的患者（對照組）的結果，顯示在納米脂肪和富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）聯合注射后，與對照注射HA相比，面部皮膚紋理得到更大程度的改善。Nanofat-PRF組的滿意度更高，提示納米脂肪和PRF可以作為皮膚老化治療的可行方案。Yao Y[30]在回顧性單中心研究中隨訪了126例接受SVF凝膠移植的患者和78例接受常規脂肪注射治療各種適應證的患者，結果所有患者均表現出面部增大和輪廓的改善。SVF凝膠組患者術后腫脹輕微，二次手術率低（10.9%）。SVF凝膠組中77.3%的患者對其結果滿意（54.5%）或非常滿意（22.8%）。相比之下，53.8%的傳統脂肪注射患者滿意（48.7%）或非常滿意（5.1%）。此外，SVF-gel填充治療顯示出有效的抗皺和皮膚再生的年輕化效果，這一點要明顯優于常規脂肪填充治療。Amirkhani MA等[31]在美國FDA批準的臨床試驗中，采用自體SVF注射鼻唇溝，并評估療效。共16例患者，收集每個患者的脂肪抽吸物，酶促處理，并測定細胞表面標記物，明確細胞成分。將最終產品注射到鼻唇溝皮下。在注射前和注射后6個月拍攝照片，并使用皮膚掃描儀（Visioline）和彈性測量裝置（Cutometer）進行評估，使用多探頭測量多個變量。結果顯示治療導致真皮密度和厚度顯著增加。此外，6個月后皮膚色素沉著和黑色素生成的比色測定保持不變。然而，從皮膚表面水分蒸發的百分比顯著降低。值得注意的是，注射1周后就無法檢測到注射的細胞了，這表明SVF細胞成分的旁分泌機制起到主要作用，而不是注射的細胞本身分化并參與皮膚重建。

世界上很多國家的干細胞治療已經在臨床上開展，有些在正規的臨床實驗階段，但是在整形美容行業，包括脂肪干細胞在內的各種干細胞治療，在各種利益的驅使下有濫用的趨勢。所以，對于干細胞治療安全性和具體機制的研究迫在眉睫，只有在安全的前提下，加上有效的監管手段才能使干細胞治療發揮功效且真正造福人類，而不是造成治療濫用的災難。

5 ?討論

自體脂肪組織的移植技術已有近百年歷史，1893年，德國醫生Neuber首次報道塊狀脂肪移植，切取上臂小塊脂肪填充面頰部凹陷，而Illouz在1986年提出顆粒脂肪移植理論后臨床應用大大增加，1995年，Coleman發明了脂肪離心技術，革命性地提高了脂肪移植的存活率，直到2001年Zuk首次報道了脂肪干細胞，使得脂肪移植治療從組織細胞水平深入到干細胞水平，Tonnard P[25]在2013年首次提出納米脂肪的概念，實際上納米脂肪治療中起主要作用的就是ADSCs，所以，從2001年起自體脂肪干細胞就已經被用于臨床，和自體脂肪移植一起治療皮膚軟組織的缺損、皮膚細小皺紋和黑眼圈等問題。各國醫生對于臨床療效的報道多是肯定的，部分皮膚活檢結果也證實皮膚厚度的變化，大體觀察顯示皮膚皺紋的改善，光澤度和皮膚彈性的增加，而且患者自我感覺也良好，未見報道任何嚴重的并發癥。然而，臨床自體脂肪隆胸術等大容量脂肪移植手術，已有較多并發癥的報道，包括囊腫、鈣化、結節及感染等，而且，此類并發癥處理起來非常棘手，沒有完美的解決辦法，會留下永久的后遺癥，這種情況也警示我們，在脂肪干細胞用于臨床時，必須重視治療的安全性，考慮遠期并發癥的可能，考慮干細胞治療更多可能的風險，只有在安全性得到保證的前提下干細胞的治療才能健康發展。

脂肪干細胞自2001年被發現并命名以來，各類研究證明其具有促進成纖維細胞合成膠原蛋白、分泌多種細胞因子、協助血管再生及抑制黑色素形成等抗衰老方面的作用，但仍需要解決以下問題：①注射后ADSCs的轉歸尚未明確，是分化成其他細胞，還是存活一定時間后自然凋亡，是否存在畸變，導致腫瘤形成可能，這對于干細胞治療也是急需解決的安全問題;②ADSCs旁分泌功能強大，分泌的細胞因子、炎癥因子、細胞外囊泡等諸多成分，功能復雜，作用機制沒有研究清楚，如何按需調控各類細胞因子的分泌等問題也是未來急需解決的;③由于倫理、法律和安全性等多方面的考慮，脂肪干細胞治療無法進行同種異體的應用，而ADSCs本身也存在老化問題，一些臨床就醫者年紀較大，而自體源性ADSCs存在抗衰老效果欠佳的可能，以至于同種異體干細胞或者其他治療需求增加，通過細胞外囊泡等非細胞成分的研究是否可以進行大量生產和異體移植問題;④納米脂肪和顆粒脂肪的獲取不需要應用實驗試劑，但脂肪干細胞的分離培養和增殖必須用到實驗試劑，在體外擴增后的細胞如何保證臨床應用的安全性，需要研究清楚并制定統一標準。這些問題需要大家在今后的工作中加以明確和解決。

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[收稿日期]2019-07-11

本文引用格式：潘盛盛，姜篤銀.脂肪干細胞在皮膚抗衰老方面的研究進展[J].中國美容醫學，2019，28（11）：158-162.