DNS法測定金針菇粗多糖含量的研究

秦瑞鑫 孫玉帥 朱奕彤 穆秀燕 張玉苗

摘要：為測定金針菇中總的粗多糖含量，采用熱水提取法提取了金針菇多糖，通過二硝基水楊酸顯色法，以葡萄糖為對照，測定了還原糖和總糖的含量，二者差值即為總的粗多糖含量。結果表明：金針菇中粗多糖含量為0.05mg/mL;DNS法的重復性、穩(wěn)定性、加樣回收均較好，提高了試驗的準確度和效率。DNS法操作簡單，所受干擾較少，適合于快速測定金針菇樣品中總的粗多糖含量。

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）18-0173-03

1引言

金針菇（Flammulinavelutiper）又名冬菇，隸屬白菇科、金線菌屬，是一種食藥兩用菌，廣泛分布于世界各地。金針菇味道鮮美，富含蛋白質和多種活性營養(yǎng)物質。其中，精氨酸和賴氨酸含量較高，有利于促進兒童智力發(fā)育，因此金針菇也被稱為“益智菇。

金針菇多糖作為其主要活性營養(yǎng)物質之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、抗衰老等多種功效，被廣泛應用于醫(yī)藥和食品加工等領域。目前，廣大研究者對于金針菇多糖的研究主要集中在分離純化、結構探析、相關產品開發(fā)等方面。金針菇粗多糖的提取及快速測定是開展相關研究工作的基礎。目前，常用的金針菇多糖提取方法有單一酶法、超聲波法、微波法。但上述方法對設備要求較高，酶易失活等缺點很難應用到實際食用菌多糖工業(yè)生產中。熱水提取法操作簡單、成本較低、靈活性強，為解決上述問題提供了途徑。

目前，常用于多糖測定的傳統(tǒng)方法有苯酚一硫酸法和蒽銅一硫酸法，但上述方法無法排除還原糖對測得結果的影響，且濃硫酸具有強腐蝕性，應用極為不便。DNS法利用在偏堿性條件下，還原糖和總糖分別與3，5一二硝基水楊酸發(fā)生顯色反應，從而可以準確、快速測定出還原糖與總糖的含量，二者差值即為多糖含量。DNS法目前已廣泛應用于多糖含量的測定。但DNS法快速測定金針菇多糖的報道較少，為此，本試驗采用熱水提取法和DNS法來測定金針菇中多糖含量，為金針菇多糖的相進一步開發(fā)利用提供參考。

2材料與方法

2.1材料與試劑

金針菇子實體、蒸餾水、無水乙醇、氯仿、酒石酸鉀鈉、苯酚、3，5～二硝基水楊酸、鹽酸、氫氧化鈉，試劑均為分析純。

2.2儀器與設備

電子天平、電熱恒溫干燥箱、離心機、植物組織研磨機、紫外分光光度計、恒溫水浴箱。

2.3方法

2.3.1標準曲線的繪制

將葡萄糖放置于干燥箱中，105℃干燥至恒重，用天平準確稱取100mg置于燒杯中，加入少量蒸餾水溶解，定容至100mL，充分混勻，即可得濃度為1mg/mL的標準葡萄糖溶液。用移液槍準確吸取0.2mL、0.4 mL、O·6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL的標準葡萄糖溶液分別放置于25mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，充分搖勻。分別移取1mL于6支潔凈試管中，加入去離子水1mL，DNS試劑2mL。搖勻后置于沸水浴加熱5min。取出后迅速冷卻至室溫，另取一潔凈試管，加入蒸餾水，做空白對照。

將以上溶液移人比色皿，設定紫外分光光度計的波長為490nm，測得吸光值。以葡萄糖質量X為橫軸，吸光度y為縱軸繪制標準曲線。

2.3.2金針菇粗多糖的提取

對所購置的金針菇進行洗凈、晾干，在55℃條件下對金針菇進行干燥至恒重，放入研缽中粉碎后放入組織研磨機進行研磨，過40目篩子，對已篩取的粉末裝袋。

準確稱取20.00g粉末置于550mL圓底燒瓶中，加入200mL蒸餾水，二者混合均勻后，煮沸1h，此過程中用玻璃棒攪拌3～4次，后經40目篩子。將留在篩子上的糊狀物重新放入蒸餾燒瓶中，加入100mI。水。重復上述步驟3次。合并蒸煮液并蒸餾濃縮至原來的1/3體積。

將上述得到的濃縮液上機離心，4000r/min，離心兩次，每次時間為5min，棄沉淀。向所得溶液中加入15mL 80%的乙醇，相同條件離心兩次，65℃條件下將沉淀烘干，得粗多糖，后研磨至粉末，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3金針菇粗多糖含量的測定

（1）金針菇粗多糖溶液的制備：精確稱取200mg粗多糖粉末，用少量蒸餾水溶解后置于100mL容量瓶中，加水至刻度線，搖勻，即得。

（2）還原糖溶液的制備：準確量取上述溶液5mI，置于10mL容量瓶中，加酚酞指示液一滴，再加入15%氫氧化鈉溶液直至溶液至微紅色，加純水定容至刻度，充分搖勻，即得此溶液。

（3）總糖溶液的制備：準確量取供試溶液1mL置于潔凈試管中，加入蒸餾水1mL和7mol/L鹽酸溶液2mL，沸水浴加熱5min后常溫冷卻，加入一滴酚酞指示液，再加入15%氫氧化鈉溶液，直至溶液出現(xiàn)微紅色，轉移至25mL容量瓶中，定容搖勻，即可。

（4）空白溶液的制備：取2.5mL水加2mL DNS溶液，混勻，沸水浴中加熱5min，待其冷卻至室溫，轉移至25mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線。

（5）顯色和比色：吸取上述溶液1mL至試管中，加入蒸餾水1mL，DNS試劑2mL，充分混勻后置于沸水浴中5min。取出后迅速冷卻至室溫，加入蒸餾水定容至25mL。以空白溶液作對照，于490nm處測定溶液的吸光值。

3結果與分析

3.1標準曲線的建立

由圖1可以得出，葡萄糖標準曲線的回歸方程為：y=5.26X-0.0382，R²=0.9997，表明在0.02～0.12mg范圍內，葡萄糖質量與吸光度之間呈現(xiàn)出良好的線性關系。

3.2粗多糖含量測定

準確量取金針菇粗多糖溶液5份，制備還原糖溶液以及總糖溶液各5份，按照2.3.3節(jié)中“顯色和比色”進行處理，依據(jù)標準曲線，結果為還原糖平均含量為0.054mg，RSD=1.25%，總糖平均含量為0.104mg，RSD=2.74%;重復性良好（表1）。因此，依據(jù)“粗多糖含量=總糖含量一還原糖含量”即得粗多糖含量為0.05mg。

3.3穩(wěn)定性試驗

準確量取金針菇粗多糖溶液5份，制備還原糖溶液以及總糖溶液，分別在制備后O、0.5h、1h、1.5h、2h測定吸光度，按照2.3.3節(jié)中“顯色與比色”進行處理，結果為還原性糖RSD=0.61%，總糖RSD=0.40%，說明在2h內穩(wěn)定性良好（見表2）。

3.4加樣回收試驗

準確量取金針菇粗多糖溶液5份，制備還原糖溶液以及總糖溶液，測定吸光度;結果為還原糖的平均回收率為99.68%，RSD=1.05%，;總糖的平均回收率為100.34%，RSD=1.30%（表3）。

4結語

本試驗中利用3，5一二硝基水楊酸在偏堿性條件下分別與還原糖及多糖水解產生的還原糖發(fā)生顯色反應，并在一定濃度范圍內，還原糖濃度和溶液顏色呈現(xiàn)正相關，通過比色法測定總糖和還原糖的含量，利用二者的差值間接求得金針菇多糖含量。DNS法可避免金針菇中原本存在的還原糖對本試驗所產生的干擾。另外，從本試驗結果來看DNS法的重復性，穩(wěn)定性，加樣回收均較好，提高了試驗的準確度和效率。因此，DNS法和熱水提取法相結合可作為快速測定金針菇多糖的方法。