一株紅酵母產類胡蘿卜素的定性及定量分析

郁桂聰 孫新軍 穆長青 趙鳳娟

摘要：指出了類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，在食品與醫學上具有很高的應用價值。紅酵母是其重要的微生物菌種來源，因其生產要求簡單、發酵周期短且發酵工藝易于調控，具有較好的規模化培養潛力而備受關注。實驗優選了1株紅酵母，提取其油脂，并運用HPLC法對其類胡蘿卜素進行了分離、鑒定及定量分析。結果成功分離鑒定出4種胡蘿卜素，即β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、紅酵母紅素和圓酵母素，并測得了其在每克油脂中的含量分別為：48ug、60ug、206ug、544ug，在每克干茵體中的含量分別為23ug、29ug、98ug、259ug，實現了對紅酵母類胡蘿卜素的定性及定量分析。實驗結果可為紅酵母提取類胡蘿卜素工藝參數的優化與優良產油紅酵母種質資源的篩選提供依據。

關鍵詞：紅酵母;類胡蘿卜素;高效液相色譜法（HPLC）

中圖分類號：TS261.1 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）18-0171-03

1引言

類胡蘿卜素（carotenoid）一般為C40的萜結構的較為多見，在空氣中不穩定，容易被氧化，但類胡蘿卜素可以作為食品添加劑和營養品，同時在醫學方面也具有很大價值，例如：預防血管硬化、抑制腫瘤發生、增加宿主免疫力和抗氧化等功能等，因而備受關注。紅酵母作為生產類胡蘿卜素的主要菌種來源，其發酵周期短和營養需求較低，生產過程易于調控，培養技術已經較為成熟，所以應用紅酵母生產類胡蘿卜素具有很高的應用價值和較好的開發前景。

類胡蘿卜素是一種發酵胞內色素，而酵母細胞壁厚不易破損，所以使得紅酵母提取類胡蘿卜素具有一定困難。在酵母細胞壁破碎眾多方法中，酸熱法是最為常見破碎細胞壁的方法。HPLC法是高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography）的簡稱，是色譜法的一個重要分支，它是利用液體作為流動相，將具有不同極性溶劑、緩沖液等流動相泵入到裝有固定相的色譜柱。利用色譜柱與不同類胡蘿卜素的結合能力不同，使得各種類胡蘿卜素通過色譜柱時間不同，繼而使各種類胡蘿卜素得以分離和鑒定。

本研究應用酸熱法提取紅酵母油脂后，選用HPLC對其進行定性和定量分析，期望為紅酵母提取類胡蘿卜素提供一些技術參考，也為將來規模化生產中優良產油紅酵母種質的篩選提供實驗依據。

2材料與方法

2.1實驗材料

紅酵母材料來源于戴維斯種質庫，菌種編號05-736，其不同培養狀態見圖l。經平板活化培養和三角瓶振蕩培養所得紅酵母發酵液，加以離心，收獲菌體沉淀物，置于培養皿中放到恒溫干燥箱中于50℃條件下烘干2h待用。

2.2實驗方法

2.2.1酸熱法提取油脂

①準確稱取3份干菌體樣品每份1.000g分別裝入到3支試管。②加入6mL濃度為3mol/L鹽酸于各試管中，然后充分混勻，靜置30min后，再放于98℃恒溫水浴鍋中。③把上述的試管分別加入8mL的石油醚與丙酮比例為20：1溶液。④再把試管放于混勻器上充分混勻，放人離心管中，4000r/min離心20min。⑤取上清液放置到干燥的進樣瓶中，氮吹儀吹干，稱重。

2.2.1HPLC分離鑒定和量化類胡蘿卜素

（1）流動相配置：流動相（A）：100L甲醇和甲基叔丁基醚和蒸餾水比例為（83：15：2），再加入3.9mL醋酸銨;流動相（B）：100L甲醇和甲基叔丁基醚和蒸餾水比例為（8：90：2），再加人2.6mL醋酸銨。

（2）流動相釋放時間及比例，見表1。

（3）色譜柱規格為聚合色譜柱型號為C30，3um，150mm。

2.2.3油脂與類胡蘿卜素稱重與計算

（1）油脂稱重與計算。將進樣瓶編號稱重，記為m1（g）（精確度0.001）;用氮氣吹干裝有油脂的進樣瓶后，稱重其重量記為m2（g）（精確到0.001）;油脂提取的計算公式：粗油脂重量M=m2-m1，則紅酵母產油率的計算公式：

Y=M/S×100%（1）

式（1）中：M=粗油脂質量（g）;y=粗油脂含量（%），S=為紅酵母干菌體質量（g）。

（2）類胡蘿卜素鑒定與計算。利用高效液相色譜儀，根據4種類胡蘿卜素保留時間不同，在計算機上所形成的峰值段與時間軸圍成的面積，與各類胡蘿卜素標準的峰面積比對，分析計算各種類胡蘿卜素的種類及含量。

3結果與分析

3.1HPLC體系中8種類胡蘿卜素標準的保留時間

8種類胡蘿卜素標準的保留時間見表2。

3.2目標紅酵母類胡蘿卜素種類的分離及鑒定

由目標紅酵母05-736經HPLC所得的色譜圖（圖2）可見，一共有7個有效峰值，其中在4.136min、23.756min、27.002min這三個時間段，不能確定是類胡蘿卜素。而在17.483min、23.304min、26.192min、29.253min這四個時間段，對應了4種類胡蘿卜素標準的保留時間，從而鑒定其分別為：β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、紅酵母紅素、圓酵母素。

3.3目標紅酵母油脂與類胡蘿卜素的定量分析

從表3可看出目標紅酵母的粗油脂得率為51.21±3.59%;而其中β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、紅酵母紅素、圓酵母素的含量依次增高，與圖2中所展示的四種類胡蘿卜素峰值段圍成的面積大小相符。與已有研究報道相比，該紅酵母在油脂含量和類胡蘿卜素含量上均表現出優勢。

4結論

通過HPLC對目標紅酵母菌株類胡蘿卜素進行了分離鑒定，成功鑒定出4種胡蘿卜素，即β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、紅酵母紅素和圓酵母素，并測得其在每克油脂中的含量分別為：48ug、60ug、206ug、544ug。在每克干菌體中的含量分別為23ug、29ug、98ug、259ug，實現了對該目標紅酵母菌株類胡蘿卜素的定性及定量分析，本研究可為紅酵母提取類胡蘿卜素工藝參數的優化與優良紅酵母種質資源的篩選奠定基礎。