三種同型發酵乳酸菌混合培養的發酵特性及對黃曲霉抑菌作用的研究

田亞東 鄒 旸 韓琳潔 劉 正 郝東升 鐘 成 彭傳文 范 寰

（1.天津科技大學工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.天津嘉立荷牧業集團有限公司，天津300402；3.天津市畜牧獸醫研究所，天津300381）

黃曲霉是一類生命力極其頑強的腐敗微生物[1]，在動物飼料中生長會導致對人體和動物的傷害，同時也是在飼料儲存、貯藏過程中引起飼料腐敗霉化的主要污染源之一。國內外對如何抑制黃曲霉生長進行了大量研究，如熱處理、紅外線處理等物理方法，添加乳酸、苯甲酸等添加劑的化學方法等，但隨著實際應用，這些傳統方法尚未證明是經濟有效可行的[2-3]。研究和開發綠色飼料添加劑產品，已經成為世界性的研究課題。目前國內外研究表明，部分乳酸菌對黃曲霉的生長和毒素的形成有一定的抑制作用[4]。植物乳桿菌、乳酸片球菌和凝結芽孢桿菌三者均為同型發酵乳酸菌[5]。在發酵過程中的代謝產物如有機酸和細菌素等物質均對雜菌有一定的抑制作用，可作為天然綠色的生物防腐劑[6]。王麗學等[7]前期研究表明凝結芽孢桿菌、植物乳桿菌和乳酸片球菌復合微生物菌劑能有效提高全株玉米青貯品質。本研究以這三種菌及其混合培養液為研究對象，研究這三種同型發酵乳酸菌及混合培養液對黃曲霉的抑菌作用，以期為飼料微生物添加劑的研制提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株：植物乳桿菌lactobacillus plantarumACCC11016 購自于中國農業微生物菌種保藏管理中心；乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiCGMCC 1.4購自于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；凝結芽孢桿菌Bacillus coagulansACCC10229購自于中國農業微生物菌種保藏管理中心；黃曲霉菌Aspergillus flavusCICC NO.2219 購自于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

培養基：MRS 培養基（Modified MRS Medium Base，MRS）購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；馬鈴薯葡萄糖（PDA）固體培養基：馬鈴薯200 g，瓊脂8 g，溶于1 L去離子水，121 ℃滅菌20 min，參考張國華[8]所描述的配方配制。

試驗儀器：LRH-250A 生化培養箱，由韶關市泰宏醫療器械有限公司生產；HNTC-2027 恒溫培養振蕩器，由天津歐諾儀器股份有限公司生產；SBA-40E 生物傳感分析儀，由山東省科學院生物研究所生產；UV-6100 紫外可見分光光度計，由上海美譜達儀器有限公司生產；常規試劑及儀器由本實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化

用無菌接種環從凍存管中取出植物乳桿菌、乳酸片球菌和凝結芽孢桿菌，分別于MRS 固體斜面上劃線，置35 ℃培養箱中培養至出現菌落，如此活化2次后挑取單菌落接于MRS液體培養基中35 ℃，120 r/min培養過夜，備用。

1.2.2 生長曲線、pH 值以及發酵液葡萄糖殘留量（RG）的測定

分別將活化好的植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結芽孢桿菌和三種菌株以OD600nm值1:1:1 比例的混合菌按10%（v:v）接種量接于MRS 液體培養基中，35 ℃，120 r/min 培養24 h，培養期間定時取樣測定菌液的OD600nm吸光度、pH 值和RG 值，繪制各菌株生長曲線、pH 變化曲線和RG 變化曲線，以觀察各菌種單獨培養及混合培養的生長變化，每組試驗3 個重復。

1.2.3 菌種的平板計數

將上述活化后的植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結芽孢桿菌及混合培養的菌液用0.85%(w:v)的無菌PBS緩沖液分別稀釋至10-7、10-8、10-9、10-10后進行涂布，35 ℃培養過夜，進行菌落計數，每組試驗3個重復。

1.2.4 抑菌試驗

1.2.4.1 黃曲霉孢子懸液的制備及指示菌濃度的確定

將黃曲霉接種在PDA 平面培養基上，在30 ℃培養箱內培養4 d后，加入一定量的無菌PBS 緩沖液刮取斜面上的孢子，將黃曲霉菌孢子洗下，收集到離心管中，用無菌的PBS 緩沖液洗滌3 次后，再用無菌紗布過濾3 次除去黃曲霉菌孢子的菌絲，進行血球計數板計數。將孢子懸液濃度調整為103、104、105、106、107孢子/ml，涂布到PDA平板上30 ℃培養[9]。

1.2.4.2 發酵上清濃縮液的制備

將上述活化后的植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結芽孢桿菌及混合培養的菌種接種到MRS液體培養基中35 ℃、120 r/min培養24 h后測定pH值，在4 ℃、10 000 r/min下離心15 min，取上清液，用酸度計測量其pH值，然后將上清液旋蒸濃縮10倍，待用。

1.2.4.3 抑菌活性的測定

抑菌實驗采用瓊脂擴散法進行測定，取指示菌孢子懸液100 μl（每個平板約含106個孢子）與經融化后保持在45 ℃左右的PDA半固體培養基混勻后倒入平板上，凝固后用內徑8 mm打孔器打孔，分別將100 μl植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結芽孢桿菌及混合培養的上清濃縮液注入孔中，于4 ℃水平放置預擴散24 h后30 ℃培養12 h 測量其抑菌圈直徑，每組試驗3 個重復[10-11]。

1.3 數據處理與分析

數據分析和圖表制作分別由IBM SPSS statistic 20.0 和Microsoft Excel 2010 完成，數據均以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 菌種的生長曲線

圖1 植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結芽孢桿菌及混合培養的生長曲線

圖1 可見，從植物乳桿菌的生長曲線圖可以看出，在2 h 左右的遲緩期后開始進入對數生長期，在22 h時達到最大OD600nm值3.482±0.003；起始pH值為5.40 在2 h 后迅速下降，在22 h 時達到最低值4.16±0.021；從發酵液葡萄糖殘留量的變化曲線可以看出，以每2 h接近1.0 g/l 的下降趨勢下降，22 h時RG值最低，為7.58±0.144，與起始發酵液RG 值相比下降了8.25 g/l。

從乳酸片球菌的生長曲線圖可以看出，在2 h 左右的遲緩期后開始進入對數生長期，在20 h時達到最大OD600nm值4.686±0.006；其pH 值從起始5.37 經過22 h下降到最低值4.21；與植物乳桿菌不同的是乳酸片球菌發酵液的RG 值要更低，24 h 時分別為7.58±0.144、4.42±0.144(P＜0.05)；與植物乳桿菌相比，乳酸片球菌的OD600nm值更高，24 h 分別為3.482±0.003、4.532±0.002(P＜0.05)。

與以上兩種菌株不同的是，凝結芽孢桿菌在6 h左右才開始進入對數生長期，而且對數期較短，12 h左右其OD600nm值達到最大值4.361±0.011；其pH 值在14 h時開始達到最低值4.26±0.025，從12～24 h之間，其pH 值變化不大，接近平穩；其發酵液的RG 值在22 h 時最低7.00±0.250，介于植物乳桿菌與乳酸片球菌之間（P＜0.05）。

三種菌以OD600nm值1:1:1 接種的混合培養液，在2 h 左右進入對數生長期，2～8 h 之間OD600nm值變化較快，8～20 h 之間有段緩慢的增長期，20 h達到最大值3.741±0.003；同樣其發酵液的pH 值變化也有兩段變化，在22～24 h 時達到最低為4.24±0.006；其發酵液RG 值在24 h 時最低7.67±0.289，6～8 h 和14～18 h 兩段時間，RG 值有兩個明顯變化(P＜0.05)。

2.2 菌種的活菌計數

表1 菌種發酵活菌測定結果(lg cfu/g)

由表1 可知同行數據，植物乳桿菌培養液在4～24 h 期間各時間點活菌數差異顯著(P＜0.05)，說明4～16 h 處于對數生長期，16～24 h 處于衰退期；乳酸片球菌培養液4～16 h 處于對數生長期，各時間點活菌數差異顯著(P＜0.05)，16～24 h 處于穩定期，各時間點活菌數差異不顯著(P＞0.05)；凝結芽孢桿菌培養液在4～24 h 期間各時間點活菌數差異顯著(P＜0.05)，4～10 h 處于對數生長期，10～24 h 處于衰退期；混合培養液在4～24 h 期間各時間點活菌數差異顯著(P＜0.05)，說明4～16 h 處于對數生長期，16～24 h 處于衰退期。

由表1 同列數據可見，只有三組數據12 h 乳酸片球菌與混合培養液、16 h 乳酸片球菌和凝結芽孢桿菌培養液無顯著性差異外(P＞0.05)，同一時間其他不同菌種之間的培養液活菌數之間均是顯著性差異(P＜0.05)。在三種菌及其混合培養24 h 過程中，植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結芽孢桿菌及其混合培養液分別在16、16、12、16 h 左右活菌數達到最大值。

2.3 指示菌黃曲霉孢子懸液濃度的確定

圖2 為不同濃度的黃曲霉孢子懸液生長48 h 后的對比圖，孢子懸液濃度為103孢子/ml 和104孢子/ml的平板，黃曲霉生長時間需5～7 d，實驗周期過長。孢子懸液濃度為107孢子/ml 的平板，因孢子濃度過高，黃曲霉菌絲生長及孢子萌發過快，不易觀察抑菌實驗結果，在105孢子/ml 和106孢子/ml 中進行選擇，從生長狀況及易于觀察方面考慮，故均以106孢子/ml濃度的菌懸液進行抑菌實驗。

2.4 菌種發酵上清濃縮液的抑菌直徑

圖3 是三種菌及其混合培養的上清濃縮液的抑制黃曲霉效果圖。從表2 可以看出，以濃度為106孢子/ml 黃曲霉為指示菌的六組數據，其中植物乳桿菌和乳酸片球菌的抑菌直徑最大（P＜0.05）。

圖2 不同濃度黃曲霉孢子生長對比（48 h）

表2 菌種發酵后上清濃縮液抑菌圈直徑的測定結果

3 討論

乳酸菌是人和動物腸道內主要的益生菌，當機體攝入乳酸菌等益生菌后，能在腸道內迅速成為優勢菌群，抑制其他有害微生物的繁殖，增加乳酸含量，降低腸道pH值，并且提高飼料適口性[12]。

黃曲霉菌是發霉變質飼料中最常見的一種真菌，其代謝產物具有很強的致病性和致癌性。有研究表明，部分乳酸菌對黃曲霉菌的生長和產毒具有抑制作用，徐進等[13]在研究中發現植物乳桿菌可顯著抑制黃曲霉生長與產毒。鄭瑋麗等[14]在研究中發現植物乳桿菌和副干酪乳桿菌對發酵乳產品壞包中的酵母菌、霉菌有不同程度抑制作用。而國內關于植物乳桿菌、乳酸片球菌和凝結芽孢桿菌及三種菌混合培養物對黃曲霉生長抑制鮮為報道。

Choi等[15]在研究中發現15 ℃條件下，泡菜發酵前期起主導作用的是檸檬明串珠菌，發酵后期清酒乳桿菌等乳桿菌開始發揮作用。張冬梅等[16]研究發現泡菜發酵前期腸膜明串珠菌占優勢，發酵后期戊糖乳桿菌成為優勢菌。本研究結合植物乳桿菌、乳酸片球菌、凝結芽孢桿菌單獨培養及混合培養液的生長曲線、pH 值、RG 值、活菌計數及對黃曲霉的抑菌直徑，混合培養液的OD600nm值、pH 值、RG 值及活菌數最大值在發酵過程中均介于三種菌之間，其24 h 發酵后上清濃縮液的抑菌直徑介于三者之間，且混合培養的對數生長期明顯變長，推測三種菌在混合培養過程中菌種生長可能會有先后順序，其原因有待進一步研究。

Lavermicocca P[17-18]分離獲得一株植物乳桿菌21B（L.plantarum 21B），將其發酵上清液濃縮10倍后進行抑菌實驗，結果表明該菌能抑制黃曲霉FTDC3226 在內的十幾種真菌的生長，與本實驗結果一致。

4 結論

在抑菌試驗中發現乳酸片球菌、植物乳桿菌、凝結芽孢桿菌及其混合培養的上清濃縮液均對黃曲霉的生長有抑制作用；乳酸片球菌、植物乳桿菌、凝結芽孢桿菌及其三者混合培養的上清濃縮液的抑菌直徑分 別 為(15.860±0.050) mm、(15.737±0.155) mm、(14.287±0.096) mm和(15.173±0.032) mm；其中植物乳桿菌和乳酸片球菌的抑菌直徑最大（P＜0.05）。