北方白菜型冬油菜花器特性及農藝性狀與含油量的相關性

白 靜，孫萬倉，馬 驪，武軍艷，蒲媛媛，何輝立，許德蓉，剡江梅，常 瑜，徐春梅，方 彥，李學才，牛早霞 ,盤榮德

(甘肅省油菜工程技術研究中心 甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室甘肅農業(yè)大學農學院，甘肅 蘭州 730070)

含油量是油菜重要品質性狀之一，并與其經(jīng)濟性狀及植物學性狀有關。因此研究與含油量相關的花器等植物學特征特性及農藝性狀，對培育高含油量油菜品種、提高油菜含油量具有重要意義[1]。近年來，作物花器研究受到廣泛關注，水稻[2-4]、油菜[5]、辣椒[6-8]、大麗花[9]和大豆[10]等作物花器性狀的遺傳研究已有大量報道。張冬青等[5]研究表明，甘藍型油菜花器大小與角果長、每角粒數(shù)呈極顯著正相關，與單株有效角果數(shù)呈顯著負相關。王國槐等[11]研究表明，甘藍型油菜每角粒數(shù)與花瓣寬呈極顯著正相關，與花瓣長呈顯著正相關。劉后利[12]研究表明，油菜含油量與種子大小和種皮色澤的深淺及厚度呈極顯著正相關。曹穎妮等[10]研究表明，大豆花柱長度與底莢高、株高呈顯著負相關。同時，研究表明mf6(多聚半乳糖醛酸酶基因)為與花粉生長發(fā)育密切相關的基因[13]，apetala為萼片和花瓣發(fā)育的調控基因[14]，myb為調控花器官發(fā)育的轉錄因子[15]，在植株花發(fā)育過程中均起到重要作用。黃榮仙等[13]對mf6定量表達分析結果表明，mf6基因不僅與油菜育性密切相關，可能也與花絲的伸長生長有關。戚曉利等[16]通過對apetala1原位雜交研究表明，其僅在花中表達并受AG抑制來決定萼片和花瓣發(fā)育。

白菜型冬油菜是我國北方重要油料作物，但關于白菜型冬油菜花器性狀與農藝性狀、含油量及蛋白質含量的相關性研究未見報道。本研究選用20份不同的白菜型冬油菜為研究材料，對其花器性狀間、花器性狀與農藝性狀、農藝性狀與含油量及蛋白質含量的相關性進行分析，并對花器差異表達基因mf6、apetala和myb進行了實時熒光定量PCR分析,以探討白菜型冬油菜花冠與千粒重及含油量間的關系，為培育高含油量白菜型冬油菜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為20份花冠直徑大小不同的白菜型冬油菜(表1)。

1.2 試驗設計

供試材料于2016年8月15日播種在蘭州新區(qū)上川試驗基地，年均氣溫5.9℃，最冷月平均最低溫約-10℃，極端低溫-28℃左右，冬季負積溫-570℃；年平均日照時數(shù)為2 659 h，無霜期為142 d；年降水量327 mm。試驗地前茬冬小麥，播前結合翻耕整地施尿素150 kg·hm-2、磷酸二銨150 kg·hm-2作基肥，其他管理同大田生產(chǎn)。試驗小區(qū)6 m2(2 m×3 m)，重復3次。2017年5月23日測定花器性狀，以天油4號大花(突變體)為供試材料對花器差異表達基因mf6、apetala和myb進行實時熒光定量PCR分析。2017年7月10日收獲后，進行農藝性狀、含油量及蛋白質含量的測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 花器測定項目 包括花冠直徑，花瓣長，花瓣寬,花萼長,花萼寬,雄蕊長(長),雄蕊長(短),雌蕊長,雌蕊直徑,單位均為mm。

1.3.2 經(jīng)濟性狀測定[17]包括株高(cm),分枝部位(cm),一次分枝數(shù),二次分枝數(shù),主花序長度(cm),角果長度(cm)，主花序結角數(shù)，全株結角數(shù)，千粒重(g)，單株產(chǎn)量(g),角粒數(shù)(粒)。

1.3.3 品質測定 采用丹麥福斯(FOSS)近紅外品質分析儀測定蛋白質含量(%)和含油量(%)。

1.3.4mf6、apetala、myb表達量測定 根據(jù)Tiangen試劑盒(DP419)說明書提取花器總RNA，按照TaKaRa cDNA(RR036A)說明書進行反轉錄，以cDNA為模板、MF6-PF：5′-TATTGGAGACGGGACGAG-3′，MF6-PR：5′- CAGTGTTTATGAGGGTGG -3′; APETALA-PF：5′- TTTCCTCGGTCTCACTGG -3′，APETALA-PR：5′-GTAAAACGTAACGCCTCT -3′; MYB- PF: 5′-GAAAAATGTTTGGATGCC -3′， MYB- PR: 5′-AATTGATGACGATGCTGG -3′為檢測引物，按照Tiangen試劑盒(FP205)說明書進行實時熒光定量PCR分析。

1.4 統(tǒng)計方法

利用Excel 2010和SPSS19軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，并進行相關性及主成分分析。

表1 白菜型冬油菜材料來源及特性

注: 表中材料均由甘肅省油菜工程技術研究中心選育。

Notes: The materials in table were all selected by Gansu Provincial Engineering Reasearch Center of Rapeseed.

采用SYBR Green I染料法進行實時熒光定量PCR，數(shù)據(jù)處理采用內參基因的dCT法，

計算公式[18]:

Ratio(reference/target)=2CT(reference )-CT(target)

2 結果與分析

2.1 參試材料花器性狀變化

參試材料間花冠直徑及其他花器性狀均存在顯著差異(圖1)。參試材料中，花冠直徑在16.22～21.27 mm之間，其中在16.0～17.2 mm和18.4～19.6 mm之間居多，各占35%，17.2～18.4 mm次之，占25%(圖2A)；花瓣長在10.18～12.90 mm之間，10.7～11.4 mm居多(圖2B)，占40%； 花瓣寬6.35～8.43 mm，35%材料在6.6～7.2 mm之間(圖2C)；花萼長5.66～7.82 mm，35%在6.2～6.8 mm之間(圖2D)；花萼寬1.57～1.89 mm，65%材料在1.6～1.8 mm之間(圖2E)；雄蕊長(長)6.40～8.03 mm，40%材料在7.0～7.5 mm之間(圖2F)；雄蕊長(短)4.71～6.39 mm，40%在5.0～5.5 mm之間(圖2G)；雌蕊長6.48～8.73 mm，35%材料在7.2～7.8 mm之間(圖2H)；雌蕊直徑0.59～0.83 mm，65%材料在0.7～0.9 mm之間(圖2I)。

圖1 20份白菜型冬油菜材料花冠直徑Fig.1 Corolla diagram of 20 winter rapeseed(Brassica rapa L.) materials

圖2 參試材料主要花器性狀頻數(shù)分布直方圖Fig.2 The histogram of the main floral organ character frequency distribution of the participants

從20份白菜型冬油菜花器性狀主成分分析結果中提取了3個主成分，累計貢獻率為66.916%，其中第一主成分貢獻最大，為41.026%，第二、三主成分貢獻率分別為14.854%和11.036%(表2)。

3個主成分各因子的特征向量(表3)表明，10個花器性狀中花冠直徑特征值最大，為0.488。在第一主成分的特征向量中，特征值較大且為正的有花冠直徑、花瓣長、花萼長、雄蕊長(長)、雄蕊長(短)和雌蕊長。因此第一主成分可綜合為花器各性狀長度相關性狀。第二主成分中特征值較大且為正的有雌蕊直徑，特征值為負且絕對值較大的有雄蕊長(長)。第二主成分主要反映了雌蕊直徑。第三主成分中特征值較大且為正的有花瓣寬和花萼寬。第三主成分可綜合為花器各性狀寬度相關性狀。

主成分分析結果，花冠直徑特征值最大，因此以花冠直徑為指示性狀，對20份供試材料進行聚類分析，在相對距離為5處，將來源地相同、品種不同的20份白菜型冬油菜花冠直徑分為3類(圖3)，第Ⅰ類群為17QX47，花冠直徑21.27 mm。第Ⅱ類群包括天油4號、PZ20、12PⅡ-12、天油258、天油178、17GL63、17QX167、17QX292和17RTS10，花冠直徑18.11(17GL63)～19.29 mm(17RTS10)。第Ⅲ類群包括17PX14、17PX17、17PX31、17PX37、17QX91、17QX94、17QX125、17OX160、17QX199和17QX283，花冠直徑16.22(17PX31)～17.41 mm(17QX91)。

表2 花器性狀3個主要主成分的特征值及方差貢獻率

表3 花器性狀主要主成分各因子的特征向量

2.2 花冠直徑與各花器性狀回歸分析

花冠直徑與花瓣長、花瓣寬、花萼長、花萼寬、雄蕊長(長)、雄蕊長(短)和雌蕊直徑正相關，與雌蕊長呈負相關，回歸方程分別為y=0.7069x+9.7913；y=1.2881x+8.3915；y=0.8538x+12.314；y=3.5985x+11.659；y=0.4415x+14.8；y=0.4457x+15.602；y=11.486x+9.6485；y=-0.1258x+18.883(圖4)。說明花冠直徑大小與花器各性狀的大小密切相關，尤其受雌蕊直徑影響較大。

2.3 花器性狀與農藝性狀的相關性

花冠直徑與株高、分枝部位、一次分枝數(shù)、主花序長度、主花序結角數(shù)、全株結角數(shù)、千粒重、單株產(chǎn)量、角果長度和角粒數(shù)呈正相關，其中與千粒重呈極顯著正相關，與二次分枝數(shù)呈顯著負相關，相關系數(shù)分別為0.663、0.240(表4)。說明白菜型冬油菜花冠直徑主要與千粒重有關，花冠直徑越大，千粒重越大、二次分枝數(shù)越少。而且花瓣寬、花萼長和雌蕊直徑也與千粒重呈極顯著正相關。因此，通過改良花器性狀提高白菜型冬油菜的千粒重是可行的。

2.4 農藝性狀與種子含油量、蛋白質含量的相關性

含油量與株高、分枝部位、主花序長度、千粒重、單株產(chǎn)量、角果長度和角粒數(shù)呈正相關，其中與千粒重呈極顯著正相關，相關系數(shù)0.321，與一次分枝數(shù)、主花序結角數(shù)和全株結角數(shù)呈負相關；蛋白質含量與株高、分枝部位、一次分枝數(shù)、主花序結角數(shù)、全株結角數(shù)和單株產(chǎn)量呈正相關，其中與全株結角數(shù)呈顯著正相關，相關系數(shù)0.280，與主花序長度、千粒重、角果長度和角粒數(shù)呈負相關，其中與千粒重呈顯著負相關，相關系數(shù)-0.232(表5)；本試驗也同樣證實了含油量與蛋白質含量呈極顯著負相關，說明含油量提高時，蛋白質含量降低。

圖3 20份白菜型冬油菜材料花冠大小聚類圖Fig.3 The corolla size dendrogram of 20 materials of winter rapeseed (Brassica rape L.)

圖4 參試材料花冠直徑與其他花器性狀間的回歸分析Fig.4 Regression analysis between Corolla diameter and other floral organ characters of tested materials

農藝性狀Agronomic traits花冠直徑Corolladiameter花瓣長Petallength花瓣寬Petalwidth花萼長Calyxlong花萼寬Calyxwide雄蕊長(長)Stamenlength(length)雄蕊長(短)Stamenlength(short)雌蕊長Pistillong雌蕊直徑Pistildiameter花柄長Budlength株高 Protein content0.199-0.0400.1260.0160.159-0.006-0.034-0.220?0.164-0.057分枝部位 Branch height0.1110.1000.0530.077-0.0020.1620.1810.1370.1290.045一次分枝數(shù) Primary number0.1030.1070.039-0.0960.0690.0700.0650.0100.0710.008二次分枝數(shù) Secondary number-0.240?-0.078-0.131-0.1600.083-0.040-0.065-0.1220.005-0.067主花序長度Length of main florescence0.071-0.085-0.1390.0620.0130.008-0.033-0.023-0.149-0.050主花序結角數(shù)Siliquae of main florescence0.117-0.1220.0040.0590.238?-0.065-0.052-0.0570.0970.048全株結角數(shù)Siliquae of complete stool0.196?-0.117-0.1170.257?0.187-0.016-0.023-0.170-0.035-0.050千粒重 1000-seed weight0.663??0.1150.295??0.292??0.1070.0600.091-0.1450.419??0.092單株產(chǎn)量 Yield per plant0.1230.100-0.0150.0930.288??-0.1090.0580.294??0.1520.102角果長度 Pod length0.042-0.0020.0190.1720.0880.0780.1390.0700.091-0.119角粒數(shù) Grain number per pod0.0290.1310.032-0.0010.1090.2070.157-0.0240.177-0.090

注:“*”表示在P<0.05水平顯著相關，“**”表示在P<0.01水平極顯著相關。下同。

Notes: “*” indicates that it is significant correlated at theP<0.05 level, and “**” indicates that it is significant correlated at theP<0.01 level. The same below.

2.5 mf6、apetala和myb基因表達量

選用天油4號大花(突變體)進行實時熒光定量PCR分析，由圖5可知，同一基因在大小不同的花器中相對表達量不同且差異顯著，mf6在大花材料中相對表達量上調了151.63%，而apetala和myb分別下調了83.80%、72.70%。mf6、apetala和myb在小花中的相對表達量無顯著差異性，而在大花中，mf6與apetala和myb差異顯著，apetala和myb無顯著性差異。

表5 農藝性狀與含油量及蛋白質含量的相關系數(shù)

注：柱狀圖上不同字母代表差異達顯著水平(P<0.05)。Note: Different letters on the histograms capped represent significant difference at P<0.05.圖5 mf6、apetala和myb在花器中的表達量分析Fig.5 Expression Analysis of mf6, apetalaand myb in floral organ

3 討 論

油菜的花由花柄(花謝后成為果柄)、萼片、花冠、雄蕊、雌蕊和蜜腺等部分組成，本試驗顯示，不同白菜型冬油菜品種花器性狀存在顯著差異，其中17QX47的花冠直徑達到21.27 mm。20份白菜型冬油菜根據(jù)花冠大小劃分為3類，第Ⅰ類群17QX47，花冠直徑21.27 mm。第Ⅱ類群包括天油4號等9份材料，花冠直徑18.11～19.29 mm。第Ⅲ類群包括17PX14等10份材料，花冠直徑16.22～17.41 mm。花冠直徑與其他各花器性狀間的回歸分析結果顯示，花冠直徑與花瓣長、花瓣寬、花萼長、花萼寬、雄蕊長(長)、雄蕊長(短)和雌蕊直徑正相關，其中受雌蕊直徑影響最大，回歸方程為y=11.486x+9.6485。張冬青等[5]研究也表明，花瓣長與花瓣寬和雌蕊長呈極顯著正相關。

油菜雌蕊形成角果，受精子房發(fā)育膨大發(fā)育成果身，花柄形成果柄，柱頭和花柱形成果喙，角果的經(jīng)濟性狀主要表現(xiàn)在有效角果數(shù)，每角粒數(shù)，千粒重及種子含油量等方面[19]。本研究表明，北方白菜型冬油菜花瓣長和花瓣寬與每角粒數(shù)和千粒重均呈正相關，尤其花冠直徑和雌蕊直徑與千粒重呈極顯著正相關，相關系數(shù)達(0.663、0.419)。說明花冠直徑和雌蕊直徑對改良農藝性狀尤其千粒重具有重要作用。王國槐等[11]研究表明，甘藍型油菜花瓣長與每角粒數(shù)呈顯著正相關，與千粒重呈負相關，花瓣寬與每角粒數(shù)呈極顯著正相關，與千粒重呈正相關。張冬青等[5]研究表明，甘藍型單雙低油菜千粒重與花瓣長和雌蕊長呈正相關，與花瓣寬呈負相關，每角粒數(shù)與花瓣寬和花瓣長呈極顯著正相關。因此在育種上改良花冠和雌蕊直徑，利于提高千粒重。

含油量和蛋白質含量是油菜重要品質性狀。研究表明，含油量與農藝性狀具有相關關系，與蛋白質含量存在顯著的負相關關系[20-22]。中國農業(yè)科學院油料作物研究所[23]研究表明，種子千粒重在2～4 g范圍內，千粒重增加，含油量提高。黃崧[19]也認為油菜大粒種子含油量高于小粒種子。韓繼祥[24]研究也發(fā)現(xiàn)，油菜蛋白質含量與千粒重呈極顯著負相關。本研究結果表明，在北方白菜型冬油菜中農藝性狀與含油量也存在這種相關關系，且千粒重與含油量呈極顯著正相關(0.321)，與蛋白質含量呈顯著負相關(0.232)。因此可以通過改良花冠直徑，進而提高白菜型冬油菜的千粒重等農藝性狀，從而改良含油量和蛋白質含量。

研究表明，mf6、apetala和myb與其他調控基因相互作用，決定花器官的發(fā)育。mf6、apetala和myb基因定量表達分析表明，mf6基因在大花突變體中相對表達量上調了151.63%，而apetala和myb基因分別下調了83.80%、72.70%。AP1過量表達會較好地促進植株開花[25]，而myb基因過表達會導致花器官發(fā)育不良，花藥不開裂[15]。可見mf6等基因對白菜型冬油菜花冠大小等花器性狀發(fā)育具有一定調控作用，但其調控機理有待進一步研究。

4 結 論

白菜型冬油菜品種間各花器性狀均存在顯著差異。以花冠直徑為指示性狀將20份白菜型冬油菜劃分為3類。花冠直徑大小與花器各性狀的大小具有密切關系，雌蕊直徑對花冠直徑影響最大。花冠直徑與千粒重呈極顯著正相關，千粒重與含油量和蛋白質含量呈顯著相關。花冠直徑的改良優(yōu)勢較大，mf6、apetala和myb基因與油菜花器生長發(fā)育密切相關，通過促進或抑制mf6、apetala和myb等基因的表達，改良花冠直徑大小，以提高白菜型冬油菜千粒重，進而改良其含油量，培育高含油量白菜型冬油菜品種是可行的。