青稞根際優良聯合固氮菌的篩選及鑒定

何建清，張格杰，趙偉進，王孝先

(西藏農牧學院生物技術中心，西藏 林芝 860000)

青稞(HordeumvulgareLinn． var．nudumHook．f．)起源于西藏，是藏族人民的主糧[1]。青稞富含多種氨基酸、維生素等營養成分，集保健和營養于一身。近年來，隨著消費觀念的轉變，青稞這種天然綠色谷物越來越受大眾青睞[2]。2010年西藏青稞種植面積19.74萬～21.3萬hm2，總產量61.2萬～63.6萬t，占整個糧食總播面積的66.9%和總產的64.7%，其栽培措施受到了廣泛的關注。提高青稞產量的關鍵肥料為氮肥[3]。然而，50%以上氮肥由于揮發作用、脫氮作用和淋失，造成嚴重的能源浪費和環境問題[4]。為避免造成環境污染，施用生物菌肥是首選[5]。

聯合固氮是自由生活的固氮菌定殖于植物根表、近根土壤或部分侵入植物根皮層組織或維管中形成的特殊固氮作用[6]。研究表明，聯合固氮菌廣泛存在于非豆科植物的根際、根表和根皮層中[7]。聯合固氮菌除了能為宿主提供氮素以外，還同時具有溶磷、分泌生長素、增強植株抗病性、抗逆境等多方面的促進植物生長的作用[8]。用這類菌研制的生物肥料具有成本低、持續效果好、增產穩定、非再生能源消耗少及對環境、食品安全等特點。同時，可以改善土壤結構，提高土壤有機質含量，改良鹽堿地，保障農牧業的可持續發展[9]。近年來，人們對非豆科植物與根系聯合的特殊固氮菌展開了廣泛研究。禾本科作物是對氮肥最具依賴性的作物，利用聯合固氮細菌在禾本科植物根部的固氮作用，在一定程度上可減少化學肥料的使用。至今報道具聯合固氮能力的禾本科植物至少有40屬100種[10]，前人對水稻、小麥、玉米、燕麥、高粱和甘蔗等禾本科植物根際聯合固氮菌的促生效應進行了較深入研究。張堃等[11]從燕麥和鹽堿地小麥根際篩選的優良聯合固氮菌對青稞主根長度(乳熟期)、地下生物量(完熟期)、粗蛋白含量(抽穗期、灌漿期和乳熟期)、子粒產量均有顯著的促進作用。但不同生境和植物，固氮菌的種類和特性不同，因此，從特定生境和植物根際分離獲得高效固氮菌株以研制適合不同生境和植物的專用生物菌肥具有十分重要的意義。西藏青稞主產區90%以上為干旱和半干旱地，土壤保水、保肥能力差，化肥利用率很低。因此，充分發揮青稞地生態系統中聯合固氮菌的固氮促生潛力，對提高西藏青稞的生產能力，保護和改善青稞的生態環境，促進西藏青稞產業的可持續發展具有重要的經濟和社會意義。本研究旨在從西藏不同地區青稞根際分離篩選具有促生作用的聯合固氮菌，為利用生物固氮在青稞生產上實現節肥減耗、加強青稞生態系統的良性循環提供科學基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根際土樣的采集 于2018 年4—6月采集西藏林芝、米林、朗縣、山南、拉薩、日喀則等地青稞的根系土壤25份，采集根際土樣時先去除表層的落葉及枯草，將整個植株帶根系小心挖出，輕輕抖落根系上的大塊土壤，用刮刀輕輕刮下黏附于根系表面約2 mm土壤，分別將采集到的根際土樣裝入無菌紙袋，并在袋上標注，帶回實驗室立即處理。

1.1.2 培養基 本文所用的Ashby無氮培養基和LB培養基參考相關文獻[12]配制。

1.1.3 青稞種子 本文所用的青稞種子為隆子縣六棱黑青稞。

1.2 方法

1.2.1 根際聯合固氮菌株的分離 采用稀釋平板分離法。稱取附著于青稞根上的土10 g放入90 mL無菌水中，28℃恒溫、超聲器超聲10 min分散微生物細胞，靜置10 min，即得10-1稀釋液，各取100 μL涂在Ashby平板上，在28℃培養5～7 d至長出單菌落。用接種環挑取不同單菌落，在Ashby平板上劃線純化3次得到單一菌落。將純化后的單菌落接種于LB平板上，4℃存放，備用；另取純化的單菌落接種于LB液體培養至對數生長期，取一定量的菌液與甘油混合，-80℃冰箱長期保存。

1.2.2 菌株固氮能力的測定 采用微量凱氏定氮法測定菌株的固氮量[13]。菌株活化后在Ashby無氮液體培養基上生長，每個菌株取1 mL菌液加入裝有50 mL Ashby無氮液體培養基的三角瓶中，置于28℃，180 r·min-1搖床上培養10 d，Ashby無氮培養液作為對照。培養結束后，12 000 r·min-1離心30 min，上清液利用微量凱氏定氮法測定各處理的氮含量。含氮量根據以下公式進行計算：

氮含量(mg·L-1)=[(V1-V2)×14×1000]/V

式中，V1為樣品滴定時用去的標準鹽酸溶液體積(mL)；V2為空白滴定時用去的標準鹽酸溶液體積(mL)；14為每毫摩爾氮的毫克數；V為菌株取液量(mL)。

1.2.3 固氮菌浸種 選擇固定氮量較強菌株進行種子萌發和幼苗生長試驗。在30℃條件下，將固氮菌株振蕩培養7 d備用。選取千粒重為40～50 g，外觀豐滿的同一批青稞種子。首先用75%乙醇消毒20 s，然后用10% NaClO浸泡10 min，浸泡后立即用無菌水沖洗4～6遍。將消毒的青稞種子分別浸入菌液中，25℃吸附1 h，于無菌操作臺上風干后，轉置于墊有潤濕濾紙的無菌培養皿內，每皿50粒，25℃黑暗培養7 d。以不接菌的培養液做對照。培養結束后，根據文獻[14]計算發芽率、發芽勢、發芽指數。用直尺量取各幼苗莖粗、株高、根長，計數側根數。

1.2.4 固氮菌株生理生化和細胞形態特征測定 按照東秀珠方法[15]，對篩選的聯合固氮菌株進行生理生化特性分析，菌體特征包括革蘭氏染色、芽孢染色和菌體大小等指標的測定。

1.2.5 16S rDNA序列測定與系統學分析 培養固氮菌，提取細胞總DNA作為基因擴增模板。利用細菌16S 通用引物27f: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r: 5-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴增細菌的 16S rRNA 基因[16]。PCR 擴增產物進行 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產物回收和純化直接送測序公司測序，序列拼接及相似性分析使用系統進化分析采用軟件MEGA5.1 鄰接法構建系統發育樹。基因比對通過美國國家生物技術信息中心 NCBI 數據庫( http: //www . ncbi. nlm. nih . gov) 在線完成。

2 結果與分析

2.1 菌種分離與純化結果

采用無氮Ashby平板表面涂抹法進行聯合固氮菌的分離，每份樣品3個重復，28℃恒溫培養5～7 d，挑選菌落光滑、大且粘稠的菌株接種到 LB平板上進行純化，結果表明，從25份青稞根須樣品中經反復分離純化出72株聯合固氮菌。

2.2 菌株固氮能力的測定

利用微量凱氏定氮法測定固氮菌株的固定氮量，發現菌株間的固氮能力存在顯著差異。和CK相比，72株菌的氮增量為0.33～26.07 mg·L-1。其中10個菌株表現較強的固氮能力(表 1)，培養7 d氮增量為17.01～26.07 mg·L-1。菌株24-2的固氮量最高，氮增量為26.07 mg·L-1，其次為菌株23-3，氮增量為23.05 mg·L-1，位于第三的是菌株21-1、35-2和40-4，氮增量分別為21.58、21.44 mg·L-1和21.51 mg·L-1，其余菌株的氮增量均在17 mg·L-1以上。

表1 部分聯合固氮菌株的氮增量

注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同。

Notes: Different lowercase letters mean significant difference between treatments (P<0.05), the same below.

2.3 聯合固氮菌對青稞種子萌發和幼苗的影響

2.3.1 聯合固氮菌對青稞種子萌發的影響 選擇表1中10株菌進行種子萌發試驗(表2)，結果表明：各供試固氮菌株對青稞種子發芽率影響不同，和CK相比，10株菌的發芽率增加幅度為-7.14%～25.00%。大多數菌株 (如 20-2、 24-2、26-1、35-2和 40-4等 )對青稞種子萌發有明顯促進作用，其中菌株20-2的效果最好，萌發率達87.50%，較CK提高了25.00%，其次是菌株26-1和40-4，萌發率均為85.0%，和CK相比，發芽率提高了21.43%。發芽勢、發芽指數和發芽率趨勢一致。

2.3.2 聯合固氮菌對青稞幼苗生長的影響 接種固氮菌對青稞幼苗生長影響測定結果 (表 3)表明：供試菌株對青稞莖粗均有促進作用，且差異顯著(P<0.05)。效果最好的是菌株23-2，和CK相比，莖粗增加了18.32%；大部分菌株(21-1、23-2、23-3、35-2、39-5)對青稞株高生長有明顯的促進作用，最高者達12.88 cm，比對照增加了7.60%；供試菌株均可促進青稞根長生長，最高者達10.37 cm，比對照增加了52.50%；菌株中除22-5和40-4外，均可促進須根數的增加。

表2 聯合固氮菌浸種對青稞種子萌發的影響

表3 聯合固氮菌浸種對青稞幼苗生長的影響

2.4 聯合固氮菌對青稞幼苗生物量的影響

由表4可知，與CK相比，菌株20-2、21-1、22-5、23-3、26-1、35-2可顯著增加青稞的鮮重和根重，分別較CK增加20.44%和37.89%、8.56%和14.54%、57.73%和74.90%、110.50%和137.44%、39.78%和59.91%、22.93%和44.93%；菌株21-1、22-5、23-3、26-1和40-4能顯著增加芽的重量，與CK相比，分別增加了1.50%、34.59%、67.67%、11.28%和15.04%。與CK相比，只有菌株23-3能顯著增加青稞幼苗干重。

2.5 固氮菌株的形態及生理生化特征

綜合表1、2、3、4結果，選取6株綜合性能較好的固氮菌進行形態觀察和生理生化特征測試(表5)，測試結果表明，6個菌株均為桿狀細菌，除菌株22-5為芽孢細菌和革蘭氏陽性菌(G+)外，其余5株菌均為不產芽孢，革蘭氏陰性菌(G-)。理化特性試驗結果表明，6 株菌對接觸酶反應、V-P 試驗、D-葡萄糖產酸反應和D-甘露醇反應結果均為陽性；氧化酶反應、明膠液化、產H2S和淀粉水解反應均為陰性；牛奶胨化和硝酸還原酶只有菌株20-2反應陽性。

2.6 固氮菌株的 16S rDNA 基因 PCR 擴增及系統發育分析

獲得6株菌的16S rDNA序列，片段大小均位于1 500 bp左右。在NCBI數據庫中搜索與其具有較高相似性的參比菌株，構建系統發育圖譜(圖1)。結合細菌的生理生化特征(見表5)，確定本研究分離篩選出的固氮菌為：菌株35-2和39-5屬于根瘤菌屬Rhizobium、菌株22-5屬于類芽孢桿菌屬Paenibacillus、菌株23-3屬于無色桿菌屬Achromobacter、菌株20-2和26-1屬于假單胞菌屬Pseudomonas。

表4 聯合固氮菌對青稞幼苗生物量的影響/(g·10株-1)

表5 6株篩選菌株的理化特性

注: “+”表示生化反應或革蘭氏染色為陽性；“-”表示生化反應或革蘭氏染色為陰性。

Notes: “+” denotes positive biochemical reaction (or gram stain); “-” denotes negative biochemical reaction (or gram stain).

圖1 聯合固氮菌的系統發育圖譜Fig.1 Dendrogram showing the phylogenetic position of the associative nitrogen-fixing bacteria

3 討論與結論

從鑒定結果看，西藏高寒地區青稞根際固氮菌類群有根瘤菌屬Rhizobium、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、無色桿菌屬Achromobacter和假單胞菌屬Pseudomonas4個屬，其優勢種群為根瘤菌屬Rhizobium和假單胞菌屬Pseudomonas。相對于其他生境和植物，該地區青稞根際固氮菌的種類較為單一，這可能與植物種類及其生存環境有關，與采樣時間、樣品保存時間與方式及所用培養基種類等也有關[17]。此外，本研究中從青稞根際分離到了固氮根瘤菌。研究表明，根瘤菌不但可以與豆科植物共生，而且可以在土壤中長期以腐生菌的狀態存在[18]。大量研究已經證實，根瘤菌可以作為植物根際促生菌，對禾本科等植物產生促生作用[19]。這種促生作用的形成，可以通過在非豆科植物根圈定殖或者作為內生菌在根內定殖。該領域的拓展，顯著擴大了根瘤菌的作用范圍，對農業的可持續發展具有重要的現實意義。

在聯合固氮研究中，菌株對宿主植物生長的影響及其固氮量是研究者們關注的核心問題。乙炔還原法( ARA)雖可通過對固氮酶活性測定來確認聯合固氮作用存在與否及固氮酶活性強弱，但不能直接而準確獲得固氮量，因此，很少用于固氮量計算[20]。目前在固氮研究中，最經典的測定技術是凱氏定氮法[21]。本研究用凱氏定氮法篩選出了6株具有較好促進青稞種子萌發和幼苗生長的菌株，關于這些菌株對青稞生長的大田促生效能、生態安全性以及最佳發酵條件等有待進一步研究。

本研究從西藏高寒地區青稞根際分離獲得的72株聯合固氮菌，氮增量為0.30～26.07 mg·L-1，其中有10個菌株的氮增量達17.0 mg·L-1以上，尤以菌株24-2的氮增量最高，為26.07 mg·L-1，其次為菌株23-3，氮增量為23.05 mg·L-1，位于第三的是菌株21-1、35-2和40-4，氮增量分別為21.58、21.44 mg·L-1和21.51 mg·L-1。通過菌株對青稞種子萌發率、莖粗、株高、根長、須根數和生物量等促生性看，菌株20-2、22-5、23-3、26-1、35-2和39-5等均表現出良好的促生效應，其中菌株20-2能顯著提高青稞的發芽率，較CK 提高了25.00%，菌株23-3能顯著增加青稞的莖粗、株高、根長、須根數和生物量，較CK提高了13.74%、3.17%、33.97%、1.31%和110.50%，將這兩株菌進行組合，有望研制出優良的青稞復合固氮菌肥。