向日葵三個谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GST基因的克隆及表達(dá)模式分析

凌云鶴,李 靜,景 兵,李春蓮，肖恩時,王中華

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是通過清除各種脅迫誘導(dǎo)的活性氧來保護(hù)細(xì)胞的重要酶。谷胱甘肽(GSH)在該酶的催化下能將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無害或低毒物質(zhì)。Wilce等在1960 年于動物中第1次發(fā)現(xiàn)GST，這些酶對解除藥物毒性具有重要作用[1]。1970年，Edwards等[2]在玉米中發(fā)現(xiàn)可與氯-S-三嗪阿特拉津除草劑結(jié)合的GST，它可以保護(hù)作物免遭損害。此后在小麥、馬鈴薯、大麥、擬南芥、煙草、甘蔗、矮松、大豆、石竹、鷹嘴豆、高粱等多種植物中克隆到了許多GST基因或其類似序列[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，GST基因在植物的所有組織中都有表達(dá)，但GST同工酶種類及其表達(dá)水平在不同物種、不同組織及不同細(xì)胞中是不同的。各種脅迫條件，如病原微生物，除草劑，重金屬離子，高鹽，高溫，低溫，機(jī)械損傷等都能誘導(dǎo)出幾種特定的GST基因表達(dá)[3]，其在植物抵抗生物和非生物脅迫中發(fā)揮著非常重要的作用。王麗萍等[4]將鹽地堿蓬的GST基因轉(zhuǎn)入擬南芥中過量表達(dá)減輕了鹽脅迫、干旱脅迫對其生長的危害[5-6]。Galle等[7]鑒定TaGSTU1B和TaGSTF6基因在小麥抵抗干旱脅迫下起作用。朱守晶等[8]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BnGR1基因的表達(dá)量隨Cd2+濃度的增加而逐漸升高，推測該基因增強(qiáng)了苧麻對鎘脅迫的適應(yīng)性；Kumar、Binh等[9-10]認(rèn)為過量表達(dá)水稻OsGSTL2基因可以增強(qiáng)擬南芥對重金屬、干旱及高鹽脅迫的抗性；Agrawal等[11]研究發(fā)現(xiàn)OsGST2顯著響應(yīng)稻瘟病菌的誘導(dǎo)，表明該基因在水稻防御反應(yīng)中具有重要作用。安秀紅等[12]發(fā)現(xiàn)蘋果中的MdGSTU1被NaCl和PEG 誘導(dǎo)表達(dá)。范玉潔等[13]研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹HbGSTU1表達(dá)受低溫等因素調(diào)控，但對ABA處理的應(yīng)答不明顯。

向日葵(HelianthusannuusL.)屬于菊科(Compositae)，是重要的油料作物，具有高產(chǎn)、高油、耐干旱、耐瘠薄、易栽培、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，是世界上最重要的大田作物之一，在中國已有四百多年的栽培歷史[14]。其葉片繁茂寬大、根系發(fā)達(dá)，既可以減少地面的水分蒸發(fā)，又能吸收大量的深層水、促使耕層可溶性鹽類下移，從而降低地表鹽分含量，從而使向日葵可以在鹽堿地中正常的生長、繁育[15-19]。目前國內(nèi)外對向日葵抗逆分子機(jī)制的研究尚處起步階段，分離鑒定其抗性相關(guān)基因，對培育抗逆轉(zhuǎn)基因向日葵品種具有非常重要的意義。本研究在本實(shí)驗(yàn)室所做的向日葵逆境轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)上，運(yùn)用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了3個鹽脅迫響應(yīng)GST基因的cDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行分析，利用實(shí)時定量PCR技術(shù)研究這3個基因在向日葵不同組織部位和不同脅迫條件下的表達(dá)，為進(jìn)一步研究該基因在向日葵抗性中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及其處理

供試材料為向日葵品種Sk02R，來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存的種質(zhì)資源。采用土培盆栽試驗(yàn)，營養(yǎng)缽大小為7 cm×7 cm，每盆裝入200 g濕潤培養(yǎng)土。每盆精選籽粒飽滿均勻且無病蟲害的種子8粒，播后正常供應(yīng)水分，幼苗兩葉一心時間苗，每盆定苗2株。

在向日葵六葉一心時期，分別進(jìn)行200 mmol·L-1的氯化鈉鹽脅迫處理、100 μmol·L-1的ABA噴施于向日葵葉片處理、4℃冷脅迫處理、43℃熱脅迫處理，將向日葵置于光溫培養(yǎng)箱(24℃，16 h光照；21℃ 8 h黑暗)中培養(yǎng)，取未處理、處理1、3、6、12、24、48 h的向日葵葉片以及未處理向日葵的根、幼葉、成熟葉、莖、幼莖、苞葉等部位，在實(shí)驗(yàn)室里用液氮處理后將其放入-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 向日葵基因組DNA的提取 用CTAB法對向日葵幼葉進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.2.2 RNA 提取與cDNA第一鏈合成 利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA，使用生物光度計檢測RNA的濃度與純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，按照Gen-Star試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，在-20℃冰箱中保存。

1.2.3GST基因的克隆 根據(jù)向日葵轉(zhuǎn)錄組測序所發(fā)現(xiàn)的GST基因，設(shè)計克隆引物(TSINGKE公司合成)。基因序列設(shè)計引物如下：

表1 引物序列

以之前從向日葵中提取的cDNA為材料，使用KOD酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(1)PCR反應(yīng)體系如下：

(2)PCR反應(yīng)程序：

PCR程序結(jié)束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，觀察結(jié)果，判斷是否成功擴(kuò)增出所需要的目的片段。按照DNA回收純化試劑盒的步驟進(jìn)行目的片段的回收。將pMDTM18-T Vector載體與回收到的目的片段進(jìn)行連接，使用CaCl2方法制備E.coli DH5α感受態(tài)，菌落PCR驗(yàn)證后送生工生物工程股份有限公司(上海)進(jìn)行測序。然后通過SEQMAN分析測序結(jié)果，與HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27進(jìn)行序列比對，確定克隆序列是否正確。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用MEGA6軟件構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育樹；基因結(jié)構(gòu)分析用Gene Structure Display Server (GSDS)軟件。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR分析 根據(jù)已克隆的向日葵GST的cDNA序列分析結(jié)果，利用Primer primier5.0設(shè)計熒光定量引物(見表2)，參照杜方等[20]的步驟進(jìn)行熒光定量PCR，進(jìn)行向日葵不同部位不同脅迫下GST基因表達(dá)分析，每個試驗(yàn)設(shè)置3個重復(fù)。所得數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行平均數(shù)統(tǒng)計， 2-△△CT法[21]計算相對表達(dá)量，以SPSS軟件進(jìn)行方差分析，LSD多重比較，利用Excel繪圖。

表2 PCR定量熒光引物

2 結(jié)果與分析

2.1 GST基因的克隆及進(jìn)化分析

通過對擬南芥和水稻的GST家族蛋白序列以及HanXRQChr04g0127901、HanXRQChr06g0177581、HanXRQChr10g0316331氨基酸序列ClustalX 2.1進(jìn)行多序列比對，再用MEGA 5.0 的neighbor-joining (NJ)(Bootstrap 1000)算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖1)。由系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，這3個基因?qū)儆赥au型，將這3個基因分別命名為HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27。

以向日葵幼葉RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA以及提取的DNA做模板，在其保守區(qū)內(nèi)設(shè)計特異引物，進(jìn)行基因擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2，根據(jù)已知的序列以及電泳出現(xiàn)的特異擴(kuò)增帶，其大小與預(yù)測長度基本相符，說明我們成功克隆了向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因。

2.2 GST基因結(jié)構(gòu)分析

由生物信息學(xué)分析得知：HaGSTU26基因DNA序列全長為1674bp，CDS(編碼蛋白序列)長666bp，編碼221個氨基酸，由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成；HaGSTU8基因DNA序列全長為2271bp，CDS長654bp，編碼217個氨基酸，由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成；HaGSTU27基因DNA序列全長為663bp，CDS長663bp，編碼220個氨基酸由1個外顯子組成，基因結(jié)構(gòu)示意圖如圖3。

圖1 部分物種GST氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the GST from several plant species

2.3 向日葵不同組織中GST基因的表達(dá)

HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因在向日葵根、幼莖、幼葉、成熟葉、苞葉和成熟莖中均有表達(dá)且表達(dá)量不同，見圖4。HaGSTU26基因在向日葵根中相對表達(dá)量最高，其次是幼葉、苞葉、成熟葉、幼莖和成熟莖，HaGSTU8基因在苞葉中相對表達(dá)量最高，其次是根、成熟葉、幼莖、幼葉和成熟莖。HaGSTU27基因在根中相對表達(dá)量最高，其次是幼葉、苞葉、成熟葉、幼莖和成熟莖。這3個基因在成熟莖中較其他組織相對表達(dá)量均最少。

2.4 向日葵在不同脅迫條件下GST基因的表達(dá)

2.4.1 鹽脅迫下GST基因的表達(dá)模式分析 由圖5可知，向日葵幼苗受到鹽脅迫后，HaGSTU26基因表達(dá)量隨時間的延長先增加，在脅迫6 h后稍有下調(diào)，但在脅迫12 h后相對表達(dá)量最高，此后逐漸降低。HaGSTU8基因表達(dá)量隨時間的延長先增加，在脅迫3 h后相對表達(dá)量最高，此后逐漸降低。HaGSTU27基因的表達(dá)量隨時間的延長先增加，在脅迫3 h后相對表達(dá)量最高，此后逐漸降低。說明向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因表達(dá)對鹽脅迫有響應(yīng)。

2.4.2 ABA處理下GST基因的表達(dá)模式分析 向日葵幼苗經(jīng)ABA處理后(圖6)，HaGSTU26基因表達(dá)量隨時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，處理12 h后相對表達(dá)量急劇增加并且達(dá)到最高值。HaGSTU8基因表達(dá)量隨時間的延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，處理24 h后相對表達(dá)量最高。HaGSTU27基因的表達(dá)量隨時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，處理12 h后相對表達(dá)量最高。說明向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因表達(dá)對ABA處理有響應(yīng)。

注 Note：M：2000 marker.圖2 向日葵HaGSTU26, HaGSTU8,HaGSTU27基因的克隆Fig.2 Cloning of sunflower HaGSTU26, HaGSTU8 and HaGSTU27 genes

圖3 向日葵HaGSTU26,HaGSTU8,HaGSTU27基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of sunflower HaGSTU26, HaGSTU8 and HaGSTU27 genes

2.4.3 冷脅迫下GST基因的表達(dá)模式分析 向日葵幼苗受到冷脅迫后(圖7)，HaGSTU26基因的相對表達(dá)量隨時間的延長呈現(xiàn)先增加隨后降低最后又升高的趨勢，脅迫3 h后相對表達(dá)量最高。HaGSTU8基因相對表達(dá)量隨時間的延長呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢。HaGSTU27基因的相對表達(dá)量隨時間的延長整體呈現(xiàn)增加的趨勢，脅迫24 h后相對表達(dá)量最高。說明向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因表達(dá)對冷脅迫有響應(yīng)，其中HaGSTU26和HaGSTU27基因上調(diào)表達(dá)，HaGSTU8基因下調(diào)表達(dá)。

2.4.4 熱脅迫下GST基因的表達(dá)模式分析 向日葵幼苗受到熱脅迫后(圖8)，HaGSTU26基因的相對表達(dá)量隨時間的延長整體呈現(xiàn)增加的趨勢，HaGSTU8基因相對表達(dá)量隨時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低然后又增加的趨勢，脅迫3 h后表達(dá)量上升，此后又下降到未脅迫時的水平，最后在脅迫24 h后，相對表達(dá)量達(dá)到最高值。HaGSTU27基因的相對表達(dá)量隨時間的延長整體呈現(xiàn)增加的趨勢，這3個基因均在熱脅迫24 h后表達(dá)量最高。說明向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27基因表達(dá)對熱脅迫有響應(yīng)。

圖4 向日葵不同組織中GST基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of GST gene in different sunflowertissues

圖5 鹽脅迫下GST基因的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of GST gene under salt stress

圖6 ABA處理后GST基因的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression of GST gene after ABA treatment

圖7 冷脅迫下GST基因的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression of GST gene under cold stress

圖8 熱脅迫下GST基因的相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression of GST gene under heat stress

3 討 論

鹽害是農(nóng)業(yè)中最重要的非生物脅迫之一，土壤中過量的鹽分積累，會減少土壤水勢，細(xì)胞膨壓，破壞土壤和植物中營養(yǎng)物質(zhì)的平衡而使植物生長緩慢，并引起毒性效應(yīng)[22]。GST在植物抵抗逆境脅迫中起到重要作用，它被分為Phi、Tau、Theta、Zeta、Lambda型、脫氫抗壞血酸還原酶(Dehydroascorbatereductases，DHARs)和TCHQD7類，其中Phi型和Tau型是植物所特有的[19, 23-24]，但目前有關(guān)向日葵GST基因的克隆還鮮少報道。本研究從向日葵品種Sk02R成功克隆了HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27這3個基因，通過進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，本研究發(fā)現(xiàn)向日葵HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27的氨基酸序列與來自擬南芥、水稻中的Tau類GST基因聚為一個類群，親緣關(guān)系最近，表明這3個基因?qū)儆赥au類GST家族成員。

有許多研究表明，GST基因在植物不同組織中表達(dá)量不同。馬立功等[25]從向日葵中克隆到1個HaGSTU1基因，在根、莖、葉、花、和種子中均能檢測到該基因的表達(dá)，且在葉中相對表達(dá)量最高，在莖中的表達(dá)量最低。安秀紅等[12]從蘋果中克隆MdGSTU1基因，其在根、莖、葉、花、果等部位中均有表達(dá)，根中的相對表達(dá)量最高。喬光等[26]發(fā)現(xiàn)，木豆的CcGST1基因在其根、莖、葉中均有表達(dá)，但根中的表達(dá)水平最高。青花菜中的GST基因在根、葉、莢中的表達(dá)豐度較高，花蕾中表達(dá)豐度較低，存在明顯的組織特異性[27]。本研究對向日葵不同器官GST基因表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在向日葵根、幼莖、幼葉、成熟葉、苞葉和成熟莖中均有表達(dá)，HaGSTU26、HaGSTU27在根中的表達(dá)量最高，HaGSTU8在苞葉中的表達(dá)量最高，HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27的表達(dá)量均在成熟莖中最低，這與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果類似，故推測這3個GST基因在向日葵的生長發(fā)育及抗逆中具有重要作用。

GST家族基因在多數(shù)植物中都參與了逆境脅迫的應(yīng)答，這在許多參考文獻(xiàn)中可以看到。An等[28]研究表明，苜蓿的MsGST(KM044312)在ABA、鹽、干旱、冷和熱等各種逆境脅迫下，其表達(dá)水平均上調(diào)。水稻在經(jīng)50 μmol·L-1Cd處理7 d后，根系的GST活性明顯增強(qiáng)[29]。胡桃楸JrGSTTau1基因經(jīng)6℃、8℃、10℃、12℃以及16℃處理的菌株中，其GST、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性表達(dá)量均上調(diào)，而H2O2、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)均下調(diào)[30]。蘋果MdGSTU1在經(jīng)150 mmol.L-1NaCl處理后，在1 h時表達(dá)量達(dá)到最高值[12]。不同非生物脅迫(干旱、鹽、低溫)可顯著誘導(dǎo)山羊草中AEGTA43277、AEGTA19581、AEGTA31937、AEGTA27563、AEGTA27835、AEGTA32578基因在根和葉片中的表達(dá)[31]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，HaGSTU26、HaGSTU8、HaGSTU27這3個基因都可以被鹽、冷、熱等非生物脅迫以及ABA處理誘導(dǎo)表達(dá)，因此我們推測該基因在抵抗非生物脅迫中具有重要的作用。本研究僅對這3個GST基因進(jìn)行了初步的表達(dá)分析，要想全面了解其在向日葵抗逆中的作用機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。