宮頸癌組織中STAT3、HMGB1 的表達及臨床意義

鄭 偉 張晗雪 曹 榮

遼寧省腫瘤醫(yī)院婦科，遼寧沈陽 110042

宮頸癌是由人乳頭瘤病毒（HPV）所引起的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，每年有52 萬新增病例，死亡病例達27 萬[1]。雖然近年來宮頸癌的早期篩查已逐漸普及，宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但仍存在年輕化的趨勢。手術及放化療等治療手段降低了患者病死率，延長了患者生存時間，但部分患者術后出現(xiàn)復發(fā)及遠處轉移，嚴重影響患者的生存預后，如何提高患者術后遠期生存率現(xiàn)成為研究的重點。信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）編碼的蛋白質是STAT 蛋白質家族的成員。在細胞外生長因子刺激下，STAT3 被生長因子受體的激酶磷酸化，形成同二聚體或異二聚體，并易位至細胞核，作為轉錄激活因子，可介導多種基因的表達，參與細胞生長、凋亡等多種細胞過程。研究[2]表明，腫瘤中STAT3 表達上調，可促進多種信號通路基因的表達，這與腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移及免疫逃逸等有關。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）屬于高遷移率族超家族的蛋白質，編碼的非組蛋白核DNA 結合蛋白能夠調節(jié)轉錄，同時，其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲浸潤及預后均有一定的相關性[3]。本研究通過分析宮頸癌患者的臨床及病理資料，采用免疫組化分別檢測STAT3、HMGB1 在宮頸癌組織中的表達及與宮頸癌患者臨床病理特征的關系，為宮頸癌術后評估復發(fā)率提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2015 年1 月～2018 年12 月于遼寧省腫瘤醫(yī)院（以下簡稱“我院”）進行宮頸癌根治術、術后病理證實的原發(fā)性宮頸癌患者的宮頸癌組織標本共65 例。年齡40～71 歲，平均（52.16±6.01）歲。同時以我院同期因子宮肌瘤行全子宮切除術的26 例子宮肌瘤患者作為對照，所有患者經(jīng)術后病理檢查明確無腫瘤存在。年齡45～59 歲，平均（50.23±5.68）歲。納入標準：①患者以往無放化療、分子靶向治療等治療史；②以國際婦產科聯(lián)盟（FIGO）于2009 年制訂的FIGO 標準進行腫瘤分期[4]。排除標準：①同時合并妊娠；②合并消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)腫瘤等其他臟器惡性腫瘤；③術前曾陰道用藥等宮頸治療；④合并生殖系統(tǒng)其他惡性腫瘤。兩組患者在性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），具有可比性。本實驗經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準后開始收集。

1.2 免疫組化檢測STAT3、HMGB1 表達

收集宮頸癌組織及正常宮頸組織標本，10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 厚度連續(xù)切片，常規(guī)鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶連接法（SP 法）染色。實驗步驟：常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，通過檸檬酸鹽緩沖液微波爐法進行熱抗原修復，滅活內源性過氧化物的活性，封閉非特異性位點。一抗為鼠抗人STAT3 單抗（賽信通上海生物試劑有限公司，批號：20141227）及兔抗人HMGB1 單克隆抗體（武漢明德生物有限公司，批號：20141103），一抗STAT3、HMGB1 的稀釋濃度均為1∶400。4℃條件下孵箱一抗孵育過夜，進行復溫，加入二抗反應后，應用DAB 染液顯色，蘇木精復染，逐級梯度脫水，中性樹脂封片。

1.3 結果判定

將切片放置于高倍鏡（400×）下，隨機選取5 個視野，并計數(shù)1000 個細胞，每個視野蛋白表達情況以染色深度評分和陽性細胞百分比評分之和表示，計算5 個視野的平均值，均值為0～2 為陰性，>2 為陽性表達[5]。染色深度評分：無染色為0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分。陽性細胞百分比評分：無染色為0 分，陽性細胞數(shù)≤25%為1 分，25%＜陽性細胞數(shù)≤50%為2 分，＞50%為3 分。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。STAT3、HMGB1 的相關性采用Spearman等級相關分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 STAT3、HMGB1 在宮頸癌組織中的表達

宮頸癌組織中均可明顯見到棕黃色細胞，且宮頸癌組織中STAT3 和HMGB1 的陽性率明顯高于正常宮頸組織（P ＜0.05）。見圖1（封三）、表1。

圖1 宮頸癌組織中STAT3、HMGB1 的表達（SP 法染色，400×）

表1 STAT3、HMGB1 在宮頸癌組織中的表達[例（%）]

2.2 STAT3、HMGB1 與臨床特征的關系

STAT3 的表達與盆腔淋巴結轉移情況、FIGO 分期、肌層浸潤深度有關（P ＜0.05），而與患者年齡、組織分化程度、腫瘤直徑、大體形態(tài)無明顯相關性（P ＞0.05）。HMGB1 的表達與患者年齡、盆腔淋巴結轉移情況及肌層浸潤深度有關（P ＜0.05），而與組織分化程度、腫瘤直徑、FIGO 分期、大體形態(tài)無明顯相關性，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表2。

2.3 STAT3 與HMGB1 的關系

由Spearman 等級相關分析，STAT3 的表達與HMGB1 的表達呈正相關（rs=0.371，P=0.020）。

3 討論

宮頸癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一[6-7]，在所有女性生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率中排第一。隨著宮頸癌宮頸涂片細胞學及HPV 基因篩查技術的發(fā)展，其發(fā)病率有逐漸降低的趨勢，隨著腹腔鏡手術方法的改良及放、化療方式的提高，病死率也有所降低，但宮頸癌術后復發(fā)率及遠處轉移依然是影響患者遠期生存率的重要因素。宮頸癌的發(fā)病現(xiàn)出現(xiàn)了年輕化的趨勢，嚴重危害婦女健康。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段的過程，腫瘤微環(huán)境中T 細胞、巨噬細胞等細胞的功能異常，導致腫瘤細胞的Wnt 等信號通路的過度活化，促進腫瘤細胞的惡性轉化并使其獲得無限增殖潛能[8]。對影響宮頸癌發(fā)展的信號通路的關鍵轉錄因子及下游關鍵癌基因的表達的研究，是近年來腫瘤研究的熱點。

表2 臨床病例特征與STAT3、HMGB1 表述的關系[例（%）]

STAT3 是屬于STAT 家族的一種重要的轉錄因子，其編碼基因位于人第17 號染色體，蛋白由750～800 個氨基酸組成。位于細胞質中的STAT3 在外界多種信號的刺激下激活，通過靶基因轉錄調控腫瘤細胞的生長、增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，最終誘發(fā)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。STAT3 通路已被證實與肺癌[9]、乳腺癌[10]等多種惡性腫瘤惡性程度及預后密切相關，Saini 等[11]研究表明STAT3 表達的增加和活化的STAT3（PIAS3）蛋白抑制劑功能的減弱或喪失，在卵巢高級別漿液性癌的惡性進程中發(fā)揮著重要作用。Morgan 等[12]研究表明STAT3 在HPV 的生命周期中發(fā)揮關鍵作用，與正常的角質形成細胞比較，含有高危HPV18 基因組的原代人角質形成細胞表現(xiàn)出STAT3 的高度磷酸化，且在HPV 陽性的宮頸疾病活檢組織中檢查到STAT3的表達和磷酸化增加，由此更加突顯了STAT3 的激活在宮頸癌發(fā)生中的作用。STAT3 亦可以通過激活S-期激酶相關蛋白2（Skp2）而使p27 基因的表達下調，進而調控細胞周期，STAT3 的高表達可通過激活Skp2/p27/p21 途徑來促進腫瘤細胞的侵襲[13]。國外學者發(fā)現(xiàn)STAT3 可通過與HOTAIR 啟動子區(qū)結合從而調控HOTAIR 轉錄，協(xié)同調控子宮頸癌細胞的增殖與遷移[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)宮頸癌中STAT3 的表達與宮頸癌的FIGO 分期、盆腔淋巴結轉移情況及肌層浸潤深度均有關，可見STAT3 在宮頸癌的惡性進展中發(fā)揮著不容忽視的作用。此外，STAT3 與宮頸癌的預后有一定關系，Huang 等[15]學者研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌中STAT3的過表達還與順鉑（DDP）耐藥性相關，降低STAT3 的表達可顯著促進宮頸癌細胞的凋亡，降低DDP 耐藥性。由此，臨床可通過治療前檢測宮頸癌組織中STAT3 的表達來評估新輔助化療后的預后情況。

HMGB1 是幾乎存在于所有的真核細胞內的一種DNA 結合蛋白，由215 個氨基酸組成，活化細胞中產生的HMGB1 是經(jīng)乙酰化后從細胞核轉移至細胞質，再經(jīng)過溶酶體胞吐到細胞外[16]，可在細胞內外發(fā)揮不同的作用[17]。其在細胞核內能夠穩(wěn)定核小體、重組修復損傷的DNA 和調節(jié)基因轉錄，在細胞外能夠促進各種細胞及組織的修復。此外，HMGB1 還參與腫瘤血管的生成及腫瘤組織的發(fā)展[18]。本研究提示HMGB1高表達于宮頸癌組織，且與患者的年齡、盆腔淋巴結轉移情況及肌層浸潤深度有關。Pang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1 在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變組織、宮頸癌組織中的表達呈逐漸增高的趨勢，且其在宮頸癌組織中的表達與淋巴結轉移、肌層浸潤深度有關，與本研究結果相符。HMGB1 與宮頸癌細胞的入侵和轉移可能通過激活NF-κB 信號通路來實現(xiàn)，且Pang 等[19]通過進一步實驗發(fā)現(xiàn)HMGB1 介導的對Hela 細胞的刺激引起了其形態(tài)學的變化，可顯著地增加細胞間空隙，降低細胞間黏附性，促進細胞的自由遷徙力。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中STAT3 與HMGB1 的表達呈正相關。說明兩指標存在一定的相互關系。有研究[20]表明，在HMGB1 介導的眾多腫瘤相關信號調控機制中，酪氨酸激酶-信號轉導及轉錄激活因子（JAK-STAT）通路是其重要的信號通路之一，在HMGB1 及其他外界信號的刺激下，JAK 激酶活化后磷酸化激活STAT3，通過促進下游基因表達促進細胞周期的進程。此外，HMGB1 亦可以通過JAK/STAT3 途徑來調控干細胞標志物Nanog 蛋白從而調控腫瘤干細胞的自我更新[21]。

綜上所述，STAT3、HMGB1 在宮頸癌中的表達升高，提示二者均參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，但二者之間的作用關系有待進一步深入研究。本研究結果提示STAT3 及HMGB1 有望聯(lián)合應用作為臨床上診斷宮頸癌及判定預后的指標，并作為潛在靶點成為治療宮頸癌的新手段。